1、August 2002VornormLebensmittelBestimmung von Saxitoxin und DC-Saxitoxin in MuschelnHPLC-Verfahren mit NachsulenderivatisierungDeutsche Fassung ENV 14194:2002VENV 14194ICS 67.120.30Foodstuffs Determination of saxitoxin and dc-saxitoxin in mussels HPLC method using post column derivatisation;German ve
2、rsion ENV 14194:2002Produits alimentaires Dtermination de la teneur en saxitoxine et endc-saxitoxine dans les moules Mthode par chromatographie liquidehaute performance aprs drivation post-colonne;Version allemande ENV 14194:2002Eine Vornorm ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmte
3、r Vorbehalte zum Inhalt oderwegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Normherausgegeben wird.Zur vorliegenden Vornorm ist kein Entwurf verffentlicht worden.Nationales VorwortDiese Europische Vornorm wurde vom Technischen Komitee 275 Lebensmittelanalytik
4、 HorizontaleVerfahren (Sekretariat: DIN) des Europischen Komitees fr Normung ausgearbeitet.Das zustndige deutsche Normungsgremium ist der Arbeitsausschuss Biotoxine des Normenausschus-ses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN.Fortsetzung 11 Seiten ENVNormenausschuss Lebensmittel
5、 und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINDeutsches Institut fr Normung e. V. DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. .Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, Ref. Nr. DIN V ENV 14194:2002-08nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet. Preisgr. 09 V
6、ertr.-Nr. 2309Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinVornorm Leerseite Vornorm EUROPISCHE VORNORMEUROPEAN PRESTANDARDPRNORME EUROPENNEENV 14194April 2002ICS 67.120.30Deutsche FassungLebensmittel Bestimmung von Saxitoxin und DC-Saxitoxin inMuscheln HPLC-Verfahren mit Nachsulend
7、erivatisierungFoodstuffs Determination of saxitoxin and dc-saxitoxin inmussels HPLC method using post column derivatisationProduits alimentaires Dtermination de la teneur ensaxitoxine et en dc-saxitoxine dans les moules Mthodepar chromatographie liquide haute performance aprsdrivation post-colonneDi
8、ese Europische Vornorm (ENV) wurde vom CEN am 14. Dezember 2001 als eine knftige Norm zur vorlufigen Anwendungangenommen.Die Gltigkeitsdauer dieser ENV ist zunchst auf drei Jahre begrenzt. Nach zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihreStellungnahmen abzugeben, insbesondere ber die Frag
9、e, ob die ENV in eine Europische Norm umgewandelt werden kann.Die CEN Mitglieder sind verpflichtet, das Vorhandensein dieser ENV in der gleichen Weise wie bei einer EN anzukndigen und die ENV aufnationaler Ebene unverzglich in geeigneter Weise verfgbar zu machen. Es ist zulssig, entgegenstehende nat
10、ionale Normen bis zurEntscheidung ber eine mgliche Umwandlung der ENV in eine EN (parallel zur ENV) beizubehalten.CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dnemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland,Island, Italien, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwege
11、n, sterreich, Portugal, Schweden, Schweiz, Spanien, der Tschechischen Republikund dem Vereinigten Knigreich.EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNGEUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATIONCOMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2002 CEN Alle Rechte der Verwertung, gle
12、ich in welcher Form und in welchemVerfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. ENV 14194:2002 DENV 14194:2002 (D)2VorwortDieses Dokument (ENV 14194:2002) wurde vom CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahrenerarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten
13、 wird.Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lndergehalten, diese Europische Vornorm bekannt zu geben: Belgien, Dnemark, Deutschland, Finnland, Frankreich,Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterrei
14、ch, Portugal, Schweden,Schweiz, Spanien, die Tschechische Republik und das Vereinigte Knigreich.1 AnwendungsbereichDiese Europische Vornorm legt ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Saxitoxin (Stx) und DC-Saxitoxin(DC-Stx) und zur qualitativen Bestimmung von Neo-Saxitoxin und den Gonyau-To
15、xinen GTX-2 und GTX-3 inMuscheln fest. Das Verfahren kann auch zum Nachweis der N-Sulfocarbamoyltoxine C-1, C-2, GTX-5 und GTX-6nach Hydrolyse angewandt und bei Vorliegen dieser Toxine zum Ausschluss falsch positiver Ergebnisse fr GTX-2,GTX-3, Neo-Saxitoxin und Saxitoxin verwendet werden. Bei Musche
16、ln ist die Bestimmungsgrenze fr Saxitoxin0,04 mg/kg Muschelfleisch und fr DC-Saxitoxin 0,03 mg/kg Muschelfleisch (Signal-Rausch-Verhltnis = 10).Die Nachweisgrenzen fr C-1, C-2, GTX-2, GTX-3, GTX-5, GTX-6 und Neo-Saxitoxin sind nicht ermittelt worden.2 Normative VerweisungenDiese Europische Vornorm e
17、nthlt durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderenPublikationen. Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationensind nachstehend aufgefhrt. Bei datierten Verweisungen gehren sptere nderungen oder berarbeitungen nurzu dieser
18、Europischen Vornorm, falls sie durch nderung oder berarbeitung eingearbeitet sind. Bei undatiertenVerweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikation (einschlielich nderungen).EN ISO 3696:1995, Wasser fr analytische Zwecke Anforderungen und Prfungen (ISO 3696:1987).3 PrinzipDie
19、PSP-Toxine (paralytic shellfish poisoning, paralytische Schalentiervergiftung) werden aus Muschelhomogenatmit einer wssrigen sauren Lsung extrahiert. Nach Zentrifugieren wird der berstand durch Festphasenextraktion(solid phase extraction, SPE) ber eine C18-Patrone gereinigt. Ein Teil des Extrakts wi
20、rd direkt zur Toxin-bestimmung in das HPLC-Gert injiziert. Nach Trennung auf der HPLC-Sule werden die Analyten bei derNachsulenderivatisierung mit Periodsure oxidiert; und die derivatisierten Toxine werden nach Ansuern fluori-metrisch bestimmt. Die HPLC-Analyse besteht aus zwei Teilen: einem System
21、zur Abtrennung der Toxine derSaxitoxingruppe (Saxitoxin, DC-Saxitoxin und Neo-Saxitoxin) und einem System zur Abtrennung der Toxine derGTX-Gruppe (GTX-2 und GTX-3). Grundlage der Identifizierung der Toxine nach Hydrolyse ist die Umwandlungder N-sulfo-carbamoyl-Toxine in ihre entsprechenden Carbamoyl
22、toxine.WARNUNG PSP-Toxine sind starke Neurotoxine. Handschuhe und Schutzbrille sollten stndig getragenwerden und alle Arbeitsschritte bei der Standard- und Probenherstellung sollten unter dem Abzugdurchgefhrt werden.Vornorm ENV 14194:2002 (D)34 Reagenzien4.1 AllgemeinesFalls nicht anders angegeben,
23、wird bei der Untersuchung nur Wasser der Qualitt 1 nach EN ISO 3696:1995verwendet.Soweit nicht anders angegeben, mssen alle Chemikalien analysenrein (p. a.) sein.Vergleichssubstanzen (Kalibriersubstanzen fr die Toxine) anderer als der angegebenen Herkunft drfen ebenfallsverwendet werden, wenn sie ei
24、ndeutig identifiziert sind und eine klar festgelegte Massenkonzentration aufweisen.4.2 Methanol4.3 Acetonitril fr HPLC4.4 Salzsure, Volumenanteil G6a = 25 % (acidimetrisch bestimmt)4.4.1 Salzsure-Lsung, Stoffmengenkonzentration c = 1,0 mol/l130 ml Salzsurelsung (4.4) werden mit 870 ml Wasser verdnnt
25、.4.4.2 Salzsure-Lsung, c = 0,1 mol/l100 ml Salzsurelsung (4.4.1) werden mit 900 ml Wasser verdnnt.4.5 Octansulfonsurelsung, c = 0,5 mol/l2,9 g Octansulfonsure Natriumsalz Monohydrat werden in 25,0 ml Wasser gelst.4.6 Phosphorsure, Massenanteil w = 85 %4.6.1 Phosphorsurelsung c = 0,5 mol/l6,7 ml Phos
26、phorsure (4.6) werden mit Wasser auf 200,0 ml aufgefllt.4.7 Ammoniaklsung, G6a = 25 % und G6a = 1 %Fr die 1 %ige Lsung werden 40 ml Ammoniaklsung G6a = 25 % mit 960 ml Wasser verdnnt.4.8 Periodsurelsung, c = 0,01 mol/l1,14 g Periodsure werden mit Wasser auf 500 ml aufgefllt.4.9 Essigsure, 100 %4.9.1
27、 Essigsurelsung 1, c = 1 mol/l57,2 ml Essigsurelsung (4.9) werden mit Wasser auf 1,0 l aufgefllt.4.9.2 Essigsurelsung 2, c = 0,2 mol/l200 ml Essigsurelsung 1 (4.9.1) werden mit 800 ml Wasser verdnnt.4.9.3 Essigsurelsung 3, c = 0,03 mol/l150 ml Essigsurelsung 2 (4.9.2) werden mit 850 ml Wasser verdnn
28、t.4.10 HeliumVornorm ENV 14194:2002 (D)44.11 Saxitoxin-Standardlsungen4.11.1 Saxitoxin-Stammlsung, Massenkonzentration G72 = 1,0 g/mlEine Kalibrierlsung wird hergestellt, die 1,0 g/ml Saxitoxin in Essigsurelsung 3 (4.9.3) enthlt. DieKalibrierlsung wird khl (bei etwa +4 C) und im Dunklen gelagert. Di
29、ese Lsung ist mindestens 6 Monate haltbar.ANMERKUNG 1 Eine Ampulle, die etwa 0,2 ml Saxitoxin-Kalibrierlsung mit der Massenkonzentration von 0,14 mg/ml enthlt,ist zum Beispiel erhltlich bei National Research Council Canada, Halifax, Kanada (Kalibriersatz PSP-1). Um eine Kalibrier-lsung mit 1,0 g/ml
30、zu erhalten, kann der Inhalt der Ampulle quantitativ in 27,8 ml Essigsurelsung 3 (4.9.3) berfhrt werden(Gesamtvolumen 28,0 ml). Das Gesamtvolumen kann durch Wgen (5.9) berprft und eingestellt werden, wobei die Dichtedes Wassers fr die Berechnungen bercksichtigt wird. Zu diesem Zweck wird die Ampulle
31、 vor dem ffnen gewogen, wobei alleGlasteile bewahrt und wieder gewogen werden, nachdem die Kalibrierlsung berfhrt wurde.ANMERKUNG 2 Eine Kalibrierlsung mit GTX-1 und GTX-4 ist auch erhltlich und darf zur Identifizierung dieser Toxineverwendet werden. Dies wurde nicht in der Zertifizierungsstudie des
32、 “Measurement anodisierte Federklemme aus Aluminium inVerbindung mit einem Filtrationskolben von 1 l Volumen.5.9 Analysenwaage6 Durchfhrung6.1 Vorbereitung der ProbeFalls erforderlich, werden die Muscheln aufgetaut. Die Schale wird einmal mit Leitungswasser abgesplt, um Sandzu entfernen, die Muschel
33、n werden ablaufen gelassen, um berschssiges Wasser zu entfernen. Das Fleisch wirdvon den Schalen abgetrennt. Etwa 100 g Muschelfleisch werden und in einem Zerkleinerungsgert (5.1) homogeni-siert. Wenn nicht unmittelbar mit der Untersuchung fortgesetzt wird, werden die homogenisierten Muschelneingefr
34、oren.6.2 Extraktionsverfahren25 g aufgetautes homogenes Muschelgemisch werden auf 100 mg ein Becherglas eingewogen und mit 25 mlEssigsurelsung 2 (4.9.2) versetzt. Der Inhalt des Becherglases wird 10 min unter stndigem Rhren mit einemMagnetrhrgert durchmischt und durch ein Faltenfilter filtriert. Der
35、 pH-Wert des Filtrats wird mit pH-Papier geprft.Wenn der pH-Wert des Filtrats nicht zwischen pH = 3 und pH = 5 liegt, wird bis zum Erreichen eines solchen pH-Wertes tropfenweise Salzsurelsung (4.4.1) zugegeben. Wenn nicht unmittelbar mit der Untersuchung fortgesetztwird, darf der Extrakt auch khl (e
36、twa +4 C) und im Dunklen bis zu hchstens 5 Tagen gelagert werden (sonstbesteht die Gefahr des Pilzwachstums im Extrakt).6.3 Reinigung der ProbeEine SPE-Sule (5.3) wird an einen Unterdruck-Mehrfachanschluss (5.2) angeschlossen, und es wird ein leichterUnterdruck eingestellt.Vornorm ENV 14194:2002 (D)
37、7Die Sule (5.3) wird nacheinander mit 3 ml Methanol (4.2), 3 ml Wasser und 1,5 ml Salzsurelsung (4.4.2)konditioniert. Es ist sicherzustellen, dass die Sule whrend dieser Arbeitsgnge nicht trocken luft.Der Unterdruck wird abgestellt, ein Sammelrhrchen unter die Sule gestellt und der Unterdruck wieder
38、 angelegt.0,5 ml des Extraktes (Vc) werden auf die Sule gegeben. Der Extrakt wird auf der Sule adsorbieren gelassen unddas Eluat in dem Sammelrhrchen aufgefangen; es ist darauf zu achten, dass die Sule whrend dieser Arbeits-gnge nicht trocken luft.Die Sule wird mit 2,0 ml Wasser gesplt und dieses El
39、uat mit dem im Sammelrhrchen vereinigt. Nach diesemArbeitsgang wird die Sule trocken laufen gelassen, um alle Flssigkeit aus der Sule zu entfernen. Der Unter-druck wird abstellt und das Sammelrhrchen mit dem gereinigten Extrakt vom Unterdruck-Mehrfachanschlussabgenommen. Die vereinigten Fraktionen w
40、erden gut durchmischt, auf 3,0 ml (Ve) mit Wasser aufgefllt und gutgemischt. Etwa 0,5 ml des Extrakts werden zur Untersuchung in einen HPLC-Flschchen berfhrt. Dies ist dieProbenmesslsung.7 HPLC7.1 HPLC-BedingungenDie HPLC-Bedingungen sind fr die beiden Gruppen von Toxinen unterschiedlich. Zu einer s
41、chematischenbersicht des Systems siehe Bild 1 4.Legende1 HPLC-Pumpe2 Sule3Heizblock4 Datenverarbeitungssystem5Detektor6 Reaktionsschlaufe7 Pumpe A8 Helium9 Oxidationsmittel10 Pumpe B11 SureBild 1 Aufbau des HPLC-SystemsVor Beginn der Messungen wird die Stabilisierung der Gerte abgewartet. Ob das Sys
42、tem stabil ist, wird berprft,indem die selbe Kalibrierlsung 2- bis 3-mal injiziert wird. Das System wird als stabil angesehen, wenn die Peak-flchen von 2 aufeinander folgenden Injektionen sich nicht um mehr als 6 % voneinander unterscheiden.Vornorm ENV 14194:2002 (D)8Fr die Saxitoxingruppe wird Elut
43、ionsmittel A bei einem Durchfluss von 0,8 ml/min und die C18-Sule von 10 cmLnge (5.6.5) verwendet.Fr die GTX-Gruppe wird Elutionsmittel B bei einem Durchfluss von 0,6 ml/min und die C18-Sule von 20 cmLnge (5.6.6) verwendet.Fr die Nachsulenderivatisierung wird die Temperatur des Reaktionssystems zur
44、Derivatisierung (5.6.7.2) auf30 C eingestellt. Das Reagenz fr die Nachsulenderivatisierung (4.19) wird dem Eluat gleich hinter der Sule beieinem Durchfluss von 0,3 ml/min (5.6.7) zugegeben. Gleich hinter der Reaktionsschlange (direkt vor dem Detektor)wird Essigsurelsung 1 (4.9.1) zugegeben. Dadurch
45、betrgt der pH-Wert der Lsung direkt vor dem Detektorweniger als pH = 5. (Dies ist blicherweise der Fall bei einem Durchfluss von etwa 0,3 ml/m). Der pH-Wert desEluenten hinter dem Detektor wird regelmig (vorzugsweise stndlich) berprft, um sicherzustellen, dass derpH-Wert fr den Nachweis aller Toxine
46、 niedrig genug ist.Der Fluoreszenzdetektor (5.6.2) wird auf eine Anregungswellenlnge von 333 nm und eine Emissionswellenlngevon 390 nm eingestellt.7.2 Injektion der Probenmesslsungen und der StandardmesslsungenFr Saxitoxin und DC-Saxitoxin betrgt das Injektionsvolumen sowohl der Kalibrierlsungen als
47、 auch derProbenlsungen 20 l. Bevor eine Reihe von Probenmessungen begonnen wird, wird eine Reihe Kalibrierlsungenvon Saxitoxin und DC-Saxitoxin in mindestens 4 verschiedenen Konzentrationen injiziert (4.11.2/4.14). Whrendder Probenreihe wird regelmig (z. B. als jede 4. Injektion) die hchste Konzentr
48、ation der Kalibrierreihe injiziert,um die Stabilitt des Systems zu berprfen (siehe 7.1).Wenn eine Probenmesslsung eine Toxinkonzentration enthlt, die die hchste Konzentration der Kalibrierreihebersteigt, ist die nach 6.3 erhaltene Probenmesslsung so mit Wasser zu verdnnen, dass die Toxinkonzentrationnicht die hchste Konzentration der Kalibrierreihe bersteigt.Fr Neo-Saxitoxin, GTX-2 und GTX-3 betrgt das Injektionsvolumen sowohl der Kalibrierlsungen als auch derProbenmesslsungen 20 l.Fr die qualitative Bestimmung von Neo-Saxitoxin werden die HPLC-Bedingungen fr die Sax
