1、Dezember 2006 Preisgruppe 12DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nurmit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 11.100.30!,pXd“9775365www.din.deDDIN-Fachbericht 153Von Willebrand Faktor AnalytikVon Willebrand F
2、actor AnalysisAlleinverkauf durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 26 SeitenDIN-Fachbericht 153:2006-12 2 Vorwort Diese Empfehlung wurde vom NA 063-03-05 AA Hmostaseologie“ des Normenausschusses Medizin (NAMed) im DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. erarbeitet. Dieser Fach
3、bericht stellt die drei wesentlichen Referenzmethoden der von Willebrand Faktor Analytik im Sinne einer Gebrauchsanweisung vor. Er soll den Anwendern in der Routinediagnostik praktische Anleitung geben. Es ist beabsichtigt, zu einem spteren Zeitpunkt die drei vorgestellten Referenzmethoden als detai
4、llierte eigenstndige Normen zu verffentlichen. DIN-Fachbericht 153:2006-12 3 Inhalt Seite Vorwort 2 1 Einleitung .5 2 Symbole und Abkrzungen8 3 Blutentnahme, Transport, Verarbeitung und Lagerung 9 4 Bestimmung des Von-Willebrand-Faktor-Antigens .9 4.1 Allgemeines9 4.2 Ausrstung.10 4.2.1 ELISA-Platte
5、n.10 4.2.2 Hardware 10 4.3 Reagenzien and andere Materialien 10 4.3.1 Gebrauchsanleitungen der Hersteller .10 4.3.2 Standards und Reagenzien 11 4.4 Flieschema als Beispiel fr einen Sandwich-ELISA mit zwei polyklonalen Antikrpern 12 4.5 Qualittssicherung und Leistungsdaten.14 4.5.1 Bezugskurve, Kalib
6、rationsbereich und Messbereich (Reportable range).14 4.5.2 Hufigkeit von Kontrollmessungen.14 4.5.3 Przision.14 4.5.4 Verdnnungsechtheit des Testsystems .14 4.5.5 Methodenvergleich und klinische Validitt.14 4.5.6 Referenzintervall14 4.5.7 Potentielle Strfaktoren15 4.5.8 Abweichungen der Kontrollen v
7、om Referenzbereich15 4.5.9 Kontrollplasmen 15 5 Bestimmung der Ristocetin-Cofaktor-Aktivitt des von Willebrand Faktors15 5.1 Allgemeines15 5.2 Anforderungen.15 5.3 Gerte und Materialien15 5.4 Reagenzien.16 5.4.1 Thrombozytensuspension16 5.4.2 Ristocetin .16 5.4.3 Referenzplasma .16 5.5 Leistungsdate
8、n 16 5.5.1 Bezugskurve, Kalibrationsbereich und Messbereich (Reportable range).16 5.5.2 Przision.16 5.5.3 Verdnnungsechtheit des Tests17 5.5.4 Methodenvergleich17 5.5.5 Klinische Relevanz 17 5.5.6 Referenzintervall17 5.6 Potentielle Strfaktoren17 6 Bestimmung der Collagenbindungsaktivitt des von Wil
9、lebrand Faktors17 6.1 Allgemeines17 6.2 Materialien und Reagenzien .18 6.2.1 ELISA-Platten.18 6.2.2 Collagen18 6.2.3 Antikrper.18 6.2.4 Puffersysteme18 6.2.5 Substrate 19 6.2.6 Referenzprparation19 6.3 Gerte und Ausrstung 19 6.4 Durchfhrung des Collagenbindungstests 19 6.4.1 Allgemeine Richtlinien19
10、 6.4.2 Erstellen der Probenverdnnungen 20 DIN-Fachbericht 153:2006-12 4 Seite 6.4.3 Mindestanforderungen. 20 6.4.4 Arbeitsschritte. 20 6.4.5 Messung 21 6.5 Auswertung und Evaluierung der Daten 21 6.6 Validierung des Testsystems 22 6.7 Referenzintervall. 22 6.8 Methodenvergleich . 22 6.9 Strfaktoren.
11、 22 Literaturhinweise . 23 DIN-Fachbericht 153:2006-12 5 1 Einleitung Mit einer Hufigkeit von 0,1 bis 1 % ist die von Willebrand-Krankheit die hufigste angeborene Blutstillungs-strung in der Bevlkerung. Sie wird autosomal vererbt, d. h., sie kann bei beiden Geschlechtern auftreten. Da der genetische
12、 Defekt im groen Molekl der fr die normale Blutstillung unerlsslichen multimeren von Willebrand Faktor Protein qualitativ und/oder quantitativ stark variiert, ist das Erscheinungsbild der Erkrankung sehr heterogen. Zwei neutrale Funktionen im Ablauf der Blutstillung werden durch den von Willebrand F
13、aktor gesteuert: in der primren Hmostase die Vermittlung der Adhsion der Blutplttchen an verletzte Gef-wnde und in der Blutgerinnung die Eigenschaft des Trgerproteins fr den Faktor VIII. Somit macht die Heterogenitt der Funktionsstrungen des von Willebrand Syndroms eine eindeutige Diagnose schwierig
14、. Dies gilt insbesondere fr milde Verlaufsformen, die erst bei Verletzungen oder opera-tiven Eingriffen zu hufig schwereren unstillbaren Blutungen fhren knnen. Die Labordiagnose als Voraussetzung fr eine erfolgreiche Therapie kann nur durch ein Spektrum von spezi-fischen hmostaseologischen Methoden
15、gesichert werden. Der humane von Willebrand Faktor (VWF) ist ein glykosyliertes Protein, welches eine Multimerenstruktur besitzt. Die N-gekoppelten und O-gekoppelten Kohlenhydratketten stellen 18,7 Prozent der gesamten Mole-klmasse dar 1. Der VWF wird von vaskulren Endothelzellen und Megakaryozyten
16、synthetisiert 2, 3. Vor der Sekretion werden VWF-Monomere durch C-terminale Disulfidbrcken im Endoplasmatischen Reticulum dimerisiert. Diese Dimere mit einer Masse von 540 kDa werden ber N-terminale Disulfidbrcken in den trans-Golgi- Vesikeln multimerisiert 4, 5, 6. Nach Freisetzung betrgt die VWF-K
17、onzentration im Plasma 5-10 g pro ml bzw. 50 nmol pro Liter. Vor allem hochmultimerer VWF wird in intrazellulren Organellen, den Weibel-Palade-Krperchen der Endothelzellen und den -Granula der Megakaryozyten gespeichert, von wo er nach Stimulation freigesetzt wird. Multimerisierung und Speicherung s
18、ind unabhngige Prozesse 7. Bei der elektrophoretischen Untersuchung des VWF in Plasma findet man eine Leiter“ von einzelnen Banden mit 500 bis 20.000 kD Molekulargewicht. Darber hinaus sind hhermolekulare Multimere vorhanden, die elektrophoretisch nicht auflsbar sind. Die einzelnen Banden sind linea
19、re Multimere, die sich um jeweils ein Dimer unterscheiden. Die Anzahl der Monomere schwankt entsprechend zwischen 2 bis ca. 40. Innerhalb der einzelnen Banden gibt es Satelliten (Triplets und Quintuplets), die durch die Abspaltung terminaler Fragmente entstehen. Unter Scherkrften verndert der VWF se
20、ine Konformation und bindet an Komponenten des Subendothels (Kollagen, Glykosaminoglykane) von geschdigten Gefwnden 8. Daran binden Thrombozyten ber ihr Membranprotein GPIb 9, werden aktiviert und setzen den -Granula gespeicherten VWF-FVIII Komplex frei. Gleichzeitig fhrt die Aktivierung der Plttche
21、n zu einer Prsentation des Proteinkomplexes GPIIb/GPIIIa auf ihrer Oberflche. Dieser stellt eine zweite Bindungsstelle dar, an welche der VWF bindet und so den Vernetzungsgrad der Plttchen erhht. Weitere adhsive Proteine wie z. B. Fibrin, Fibronectin, Vitronectin mit der Sequenz Arg-Gly-Asp (RGD) bi
22、nden ebenfalls an GPIIb/GPIIIa und lassen einen Thrombus entstehen, der die verletzte Gefwand verschliet. Diese funktionelle Qualitt des VWF ist abhngig von der Lnge der Multimere, d. h., hochmolekulare Molekle sind biologisch aktiver als niedermolekulare, da diese mit der greren Zahl von Bindungsst
23、ellen einen hheren Vernetzungsgrad von Thrombozyten und Endothel erzielen knnen. Neben der initiierenden Funktion in der zellulren Hmostase wirkt der VWF auch als Trger und Stabilisator des FVIII bis zu dessen Funktionsort und frdert dadurch die plasmatische Gerinnung. Eine N-terminale Multimerisier
24、ung des VWF ist fr die Ausbildung einer FVIII-Bindungsstelle notwendig 10. Eine bersicht der Kurzbezeichnungen fr die Eigenschaften des VWF gibt Tabelle 1. DIN-Fachbericht 153:2006-12 6 Tabelle 1: Nomenklatur des Faktor VIII-von Willebrand Faktor-Komplexes 11 VWF von Willebrand Faktor: ein Glykoprot
25、ein groer Moleklmasse, das in der primren Hmostase sowohl fr die Interaktion Thrombozyt - Gefwand als auch von Thrombozyten untereinander verantwortlich ist, und in der sekundren Hmostase das Trgerprotein des FVIII ist. Der Genort liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 12. FVIII Faktor VIII: ein Gl
26、ykoprotein groer Moleklmasse, das als Cofaktor des Tenase-Komplexes im intrinsischen Gerinnungssystem wirksam ist. Der Genort liegt auf dem X-Chromosom. VWF:Ag Antigene Eigenschaft des VWF-Molekls VWF:RCo Ristocetin-Cofaktor-Aktivitt VWF:CB Kollagenbindungsaktivitt VWF:FVIIIB Faktor VIII-Bindungsakt
27、ivitt FVIII:C Gerinnungsaktive Eigenschaft des FVIII-Molekls FVIII:Ag Antigene Eigenschaft des FVIII-Molekls. VWS von Willebrand Syndrom Die Lnge der VWF-Multimere im Plasma wird in vivo durch eine plasmatische Protease reguliert 12,13. Die Defizienz der VWF-spaltenden Metalloprotease ADAMTS13 ist m
28、it thrombotischer thrombozytopenischer Purpura (TTP) assoziiert. In vitro zeigt eine Abnahme von Multimeren hherer Molekulargewichte die Degeneration des VWF whrend der Behandlung der TTP 14. Das VWS ist die hufigste hereditre Blutungsstrung mit einer Prvalenz von 1:1.000 bis 1:10.000. Es lassen sic
29、h im Wesentlichen 3 Haupttypen unterscheiden, wobei Typen 1 und 2 autosomal dominant und Typ 3 rezessiv vererbt werden 15. Typ 1 beschreibt eine quantitative Verminderung des VWF. Typ 2 beinhaltet Funktionsstrungen und Typ 3 ein komplettes Fehlen des VWF. Beim Typ 2 lassen sich verschiedene Subtypen
30、 des VWS differenzieren. Eine Sonderform stellt der Typ 2N (Normandy) dar, bei dem die VWF-FVIII Bindung gestrt ist. Darber hinaus gibt es viele erworbene Strungen des VWF, die sich in der Konzentration oder der Funktion uern knnen. Alle Formen des VWS werden auf Basis einer Reihe von Laboranalysen
31、wie Blutungszeit, Thrombozytenzahl, VWF-Antigen, Ristocetin-Cofaktor und Kollagenbindungsaktivitt, Ristocetin-induzierter Plttchen-Agglutina-tion (RIPA), FVIII-Aktivitt, Filtertest mit hohen Scherkrften und gegebenenfalls FVIII-Bindungstest und Multimerenanalyse differenziert 16 (Tabelle 2). Tabelle
32、 2: Die wichtigsten Typen und Subtypen des hereditren VWS und ihre funktionelle Differentialdiagnose Blutungs- zeit Thrombo-zytenzahl VWF:RCo VWF:CB VWF:Ag RIPA FVIII:C IVBT Typ 1 n /n Typ 2 A n Typ 2 B /n /n /n Typ 2 M n /n /n /n Typ 2 N n /n /n /n /n /n Typ 3 n fehlt fehlt fehlt fehlt n: normal DI
33、N-Fachbericht 153:2006-12 7 Die Blutungszeit wird seit nahezu 100 Jahren in den verschiedensten Modifikationen zur Diagnostik von Strungen der primren Hmostase durchgefhrt. Die Ergebnisse der meisten Modifikationen der Blutungszeit sind wegen mangelnder Standardisierbarkeit und Reproduzierbarkeit we
34、nig aussagefhig fr die Diagnostik von Blutungsstrungen. Mit der Template-Blutungszeit nach Mielke 67 unter Verwendung kommerzieller Einmalgerte ist heute eine weitgehend standardisierte sensitive Methode verfgbar. Dieser Fachbericht gibt eine Anleitung zur Durchfhrung und zum Einsatz der vielfltigen
35、 Analyseverfahren fr die Diagnostik des von Willebrand Syndroms. Die Tests fr Gehalt und Aktivitten knnen auer zur Differentialdiagnose eines erworbenen oder vererbten VWS auch zur Bestimmung einer erhhten Aktivitt des VWF und damit zur Abschtzung eines thromboembolischen und kardiovaskulren Risikos
36、 und auch zur Differentialdiagnose eines Bernhard-Soulier-Syndroms bei pathologischer RIPA angewandt werden. In analoger Weise knnen die Tests auch zur Aktivittsbestimmung und Charakterisierung des VWF in pharmazeutischen Prparaten verwendet werden. Fr die Bestimmung des VWF:Ag stehen mehrere immuno
37、logische Methoden zur Verfgung. Der erste und frher am hufigsten angewandte Test, Elektroimmunoassay nach Laurell in der Modifikation nach Zimmerman 17, ist heute weitgehend durch Sandwich- Enzymimmunoassay (ELISA) mittels poly- oder monoklonaler Antiseren verdrngt. Kompetitive ELISA-Tests spielen e
38、ine untergeordnete Rolle. In den letzten Jahren gewinnen automatische Tests auf Latex-Basis an Bedeutung. Die VWF:RCo-Aktivitt wird durch Messung der Agglutinationsrate von frischen, lyophilisierten oder fixierten normalen Thrombozyten bestimmt. Die Thrombozyten werden mit Ristocetin resuspendiert,
39、Citratplasma wird zum Testansatz gegeben und die Erhhung der Lichttransmission gemessen. Die so erhaltene Transmis-sionsnderung wird mit der Verdnnungsreihe eines Referenzplasmas verglichen, um somit die Aktivitt zu bestimmen. Der Test kann unter Verwendung eines klassischen Aggregometers oder als m
40、akroskopischer Tpfeltest durchgefhrt werden. Daneben ist eine Automatisierung mglich. Der VWF:CB-Aktivitt liegt die Wechselwirkung des VWF mit Kollagen zugrunde. Das Testprinzip des Kollagenbindungstests (CBA) basiert auf konventioneller ELISA-Technologie. VWF kann an Kollagen-beschichtete ELISA-Pla
41、tten binden und mit enzymmarkierten Antikrpern und einem Enzymsubstrat photo-metrisch bestimmt werden. Die verschiedenen Multimere des VWF lassen sich durch Gelelektrophorese in einem groporigen Trger-material im elektrischen Feld auftrennen. Die so getrennten VWF-Multimere werden anschlieend durch
42、geeignete Methoden detektiert. Dieses kann durch direkte Immunfrbung im Agarosegel, Blotting und anschlieende Frbung mit spezifischen Antikrpern, mit Lumineszenz - oder Chemolumineszenz - Methoden sowie mit autoradiographischen Nachweismethoden erfolgen. Dokumentiert wird entweder die Anzahl der zhl
43、baren Multimerenbanden oder es wird zur Auswertung die densitometrisch bestimmte Verteilung der Bandenintensitten herangezogen. Verwendet man hherprozentige Gele (z. B. 1,5 %- bis 3 %ige Agarose), so lassen sich auch Substrukturen der verschiedenen Multimeren visualisieren. Auf Grund einer fehlenden
44、 Standardisierung von RIPA- und Multimeren-Analyse sollte diese nur spezialisier-ten Laboratorien vorbehalten bleiben, daher wird in diesem Fachbericht auf eine differenzierte Beschreibung dieser Testmethoden verzichtet. DIN-Fachbericht 153:2006-12 8 2 Symbole und Abkrzungen Tabelle 3: Symbole und A
45、bkrzungen ABTS 2,2-Azino-bis-(3-Ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsure)-Diammoniumsalz ADAMTS13 A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 repeats 13 BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin) CBA Kollagenbindungstest (collagen binding assay) DDAVP Desmopressin ELISA Enzyme Linked Im
46、munosorbent Assay FITC Fluorescein-Isothiocyanat FVIII:Ag Faktor VIII-Antigen FVIII:C Faktor VIII-Gerinnungsaktivitt HRP Meerrettich-Peroxidase (Horseradish Peroxidase) HUS Hmolytisches Urmisches Syndrom IVBT in-vitro-Blutungszeit NIBSC National Institute for Biological Standards and Controls OD opt
47、ische Dichte OPD o-Phenylendiamin PBS Physiologischer Phosphatpuffer (Phosphat Buffered Saline) QMS Qualittsmanagementsystem RILIBK Richtlinie der Bundesrztekammer RIPA Ristocetin-induzierter Plttchen-Agglutinationstest RSD Relative Standardabweichung (Relative Standard Deviation) RT Raumtemperatur
48、SDS Sodiumdodecylsulfat TMB 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin TTP Thrombotische Thrombozytopenische Purpura WHO World Health Organization VWF von Willebrand Faktor VWF:Ag von Willebrand Faktor Antigen VWF:CB von Willebrand Faktor Kollagenbindungsaktivitt VWF:RCo von Willebrand Faktor Ristocetin-Cofaktor Aktivitt VWS von Willebrand Syndrom DIN-Fachbericht 153:2006-12 9 3 Blutentnahme, Transport, Verarbeitung und Lagerung Die Entnahme von Blut fr Gerinnungsuntersuchungen erfordert besondere Sorgfalt. Es existieren entspre-chende Vorschriften (DIN 58905-1 18). Im Gegensatz zu vielen
