1、 AFNOR 2002 Tous droitsrservsFA122026 ISSN 0335-3931NF V 04-415Octobre 2002Indice de classement : V 04-415ICS : 67.050 ; 67.120.10 ; 67.120.30Viandes, produits base de viandes et produits de la pcheDtermination de la teneur en L(-)hydroxyproline et calculde la teneur en collagneE : Meat, meat produc
2、ts and fishery products Determination of the L(-)hydroxyproline content and calculation of the collagen contentD : Fleisch, Fleischprodukte und Fischereiprodukte Bestimmung des Gehaltes an L(-)Hydroxyprolin und Berechnung des Kollagenanteils Norme franaise homologue par dcision du Directeur Gnral dA
3、FNOR le 5 septembre 2002 pour prendre effetle 5 octobre 2002.Remplace la norme homologue NF V 04-415, davril 1987.Correspondance Le prsent document est quivalent la Norme internationale ISO 3496:1994.Analyse Le prsent document dcrit une mthode pour la dtermination de la teneur enL(-)hydroxyproline e
4、t le calcul de la teneur en collagne, dans les viandes et produits base de viande, et dans les produits de la pche et leur prparation (par exempleviande de volaille, de gibier, produits de charcuterie, foie gras, poissons, crustacs,mollusques, terrine de poissons, etc.).Technique manuelle ou automat
5、ise (flux continu, annexe 2).Descripteurs Thsaurus International Technique : produit alimentaire, viande, produit base deviande, analyse chimique, dosage, hydroxyproline, mode opratoire, calcul, fidlit.Modifications Par rapport au document remplac, la mthode a t entirement ractualise. Lesrsultats de
6、ssais interlaboratoires ont t introduits afin de disposer de donnes defidlit. AFNOR 2002 AFNOR 2002 1er tirage 2002-10-Fdite et diffuse par lAssociation Franaise de Normalisation (AFNOR) 11, avenue Francis de Pressens 93571 Saint-Denis La Plaine Cedex Tl. : + 33 (0)1 41 62 80 00 Fax : + 33 (0)1 49 1
7、7 90 00 www.afnor.frCorrectionsMthodes danalyse des produits carns AFNOR V44CMembres de la commission de normalisationPrsident : MME CARLIER Secrtariat : MME DRUEZ-VERITE AFNORM BERTHION LABO DEPARTEMENTAL SARTHEM BERTHOLON LABO DEPT FRANK DUCOMBEM BITON CTCPAMME BLACHERE DGCCRF LABO INTERREGIONALMM
8、E CABANDE ADIVMME CARLIER CTSCCVM CHAUVEAU SBS SOC BRETONNE DE SALAISONSMME CROY SILLIKER SAMLLE DA RIZ CTSCCVM DEBERT CLABO CONSEIL FRANCEM DENIS LABO WOLFFMME DUPLANTIER ADOUR BIO CONSEILMME DUPONT DGCCRF LIRFMME ETIENNE IFREMERMME GIORGO DGCCRF LABO INTERREGIONALMME GOURET LDA 22M GOVAERTS SSHA I
9、SHAMME LACHAMBRE LABO VETERINAIRE DEPARTEMENTALMME LANGEVIN CAR CTRE ANALYSES cette liste nest pas exhaustive de la rglementation sappliquant auxproduits faisant lobjet du prsent document : le lecteur est invit se rapprocher des services officiels comptentsen la matire.Directive 64/433/CEE du Consei
10、l, du 26 juin 1964, relative des problmes sanitaires en matire dchangesintracommunautaires de viandes fraches, modifie.Directive 71/118/CEE du Conseil du 15 fvrier 1971, relative des problmes sanitaires en matire dchangesde viandes fraches de volaille, modifie.Directive 91/495/CEE du Conseil du 27 n
11、ovembre 1990, concernant les problmes sanitaires et de police sanitairerelatifs la production et la mise sur le march de viandes de lapin et de viandes de gibier dlevage, modifie.Arrt du 29 fvrier 1996, fixant les conditions sanitaires de production et de mise sur le march de viandeshaches et de prp
12、arations de viande (JORF du 23.03.96), modifie.Arrt du 22 janvier 1993, relatif aux conditions hyginiques et sanitaires de production, de mise sur le march etdchanges de produits base de viande (JORF du 16.03.93), modifie.Directive 94/65 CE du Conseil du 14 dcembre 1994, tablissant les exigences app
13、licables la production et lamise sur le march de viandes haches et de prparation de viandes (JOCE L 368 du 31.12.94), modifie.Directive 77/99 CEE du 21 dcembre 1976, relative des problmes sanitaires en matire dchange intracom-munautaires de produits base de viande, et modifiant la Directive 64/433/C
14、EE (JOCE L du 31.01.77), modifie.Dcret n 93-999 du 9 aot 1993, relatif aux prparations base de foie gras, modifie.Directive 91/493/CEE du Conseil du 22 juillet 1991, fixant les rgles sanitaires rgissant la production et la misesur le march des produits de la pche, modifie.3 Termes et dfinitionsPour
15、les besoins du prsent document, les termes et dfinitions suivants sappliquent.3.1teneur en L(-)hydroxyprolinedtermine selon la prsente norme, et exprime en pourcentage en masse3.2teneur en collagneteneur en L(-)hydroxyproline multiplie par le facteur conventionnel 84Principe Libration de la L(-)hydr
16、oxyproline par hydrolyse acide, oxydation par la chloramine T et formation duncompos de couleur rouge avec le p-dimthylaminobenzaldhyde, mesure photomtrique une longueur dondede 558 nm. 5 NF V 04-4155 Ractifs et consommablesTous les ractifs utiliss sont de qualit analytique.5.1 EauEau de qualit conf
17、orme, au moins, la catgorie 3 de la norme NF EN ISO 3696.5.2 Acide chlorhydrique en solution environ 6 M ou acide sulfurique en solution environ 3 Macide chlorhydrique (20= 1,19 g/ml) 500 mleau QSP 1 000 mloueau 750 mlajouter lentement en agitant :acide sulfurique (20= 1,84 g/ml) 320 mlrefroidir tem
18、prature ambianteeau QSP 2 000 ml5.3 Solution tampon pH 6,0acide citrique monohydrat 33,0 ghydroxyde de sodium 17,0 gactate de sodium trihydrat Na(CH3CO2).3H2O 97,0 geau 330 ml environquand tout est dissous, ajouter :propanol-1 ou 2 200 mlAjuster le pH 6,0 avec une solution concentre dacide citrique,
19、 et complter 1000 ml avec de leau, cette solu-tion reste stable pendant deux mois lobscurit et une temprature infrieure + 8 C.5.4 Ractif la chloramine TN-chloro-p-tolune sulfonamide, sel de sodium trihydrat (chloramine T) 1,41geau 10 mlajouter successivement cette solution :propanol-1 ou 2 10 mlsolu
20、tion tampon (5.3) 80 mlCette solution peut tre conserve 1 semaine une temprature infrieure + 8 C et lobscurit.5.5 Ractif colorimtriquedissoudre lentement :p-dimthylaminobenzaldhyde 10 gdans acide perchlorique en solution 60% (m/m) 35 mlajouter lentement :propanol-1 ou 2 65 mlCette solution doit tre
21、prpare le jour de son utilisation.NF V 04-415 6 5.6 L(-)hydroxyproline, solutions talonsSolution mre dacide hydroxypyrrolidine-carbonique (hydroxyproline) :hydroxyproline 50 mg pess 0,001 g prseau QSP 100 mlCette solution peut tre conserve 2 mois, au maximum, une temprature infrieure + 8 C.Solution
22、intermdiaire prparer le jour de son utilisation :solution-mre 5 mleau QSP 500 mlSolutions talons partir de la solution intermdiaire, prparer une gamme avec, au moins, 4 solutions talons dans la zone delinarit, soit entre 0 et 5 g/ml de L(-)hydroxyproline.NOTE Une gamme de 0,0 g/ml 2,5 g/ml de L(-)hy
23、droxyproline couvre la majorit du domaine dapplication du prsentdocument. Toute autre gamme couvrant la zone de travail du laboratoire, et sous rserve que la courbe soit linaire, convient.Les solutions talons peuvent tre conserves une semaine une temprature infrieure + 8 C.5.7 Papier exempt de compo
24、ss azots5.8 Rgulateurs dbullition : pierre ponce ou billes de verre dans le cas dhydrolyse par lacide chlorhydrique.5.9 Papier-filtre : papier filtration rapide.6 Appareillage et verrerieMatriel courant de laboratoire et, en particulier :6.1 Balance analytique dont la valeur de lchelon de vrificatio
25、n e est gale 0,001 g.6.2 Ballon ou tube hydrolyse, ventuellement jaug, dune capacit de 100 ou 200 ml, muni dun rfrigrant air ou eau.6.3 Appareil de chauffage appareil lectrique adapt au ballon, ou au tube, et permettant dobtenir lbullition de lacide ; tuve (uniquement dans le cas dhydrolyse avec lac
26、ide sulfurique).6.4 Bain deau thermostat rglable 60 C 2 C.6.5 Spectrophotomtre permettant des mesures une longueur donde de 558 nm 2 nm ou colorimtrephotolectrique, quip dun filtre interfrentiel avec absorption maximale 558 nm 2 nm.6.6 Cuves de 10 mm de parcours optique.6.7 Verrerie de laboratoire d
27、e classe A pour la courbe dtalonnage et, au minimum, de classe B pour lesdosages. 7 NF V 04-4157 chantillonnageLa prsente norme ne traite pas du problme de lchantillonnage.8 Prparation de lchantillon pour essaiLchantillon est prpar conformment aux spcifications dcrites dans la norme NF V 04-416 Prpa
28、ration delchantillon en vue de lanalyse de composition.9 Mode opratoireNOTE Sil y a lieu de vrifier si la limite de rptabilit est satisfaite (11.2), effectuer deux dterminations spares,conformment au prsent mode opratoire dans les conditions de rptabilit.9.1 Prise dessaiPeser 0,01g prs, entre 2 et 8
29、 g environ (selon la teneur estime en L(-)hydroxyproline) de lchantillon prpar,soit directement dans le ballon ou le tube dhydrolyse (6.2), soit sur un morceau de papier (5.7). Soit m cette masseen grammes.9.2 Hydrolyse9.2.1 Introduire la prise dessai dans le ballon ou le tube (6.2).9.2.2 Ajouter en
30、tre 50 et 100 ml de solution dacide (5.2.) et, en cas dutilisation dacide chlorhydrique, unrgulateur dbullition (5.8). Avec lappareil de chauffage (6.3) amener bullition douce, et la maintenirpendant 16 19 heures. NOTE 1 Lbullition douce de lacide chlohydrique est obtenue environ 110 C. NOTE 2 Lhydr
31、olyse avec lacide sulfurique est ralise environ 107 C 3 C. Une temprature excessive entraneune dterioration de lhydrolysat.NOTE 3 Lhydrolyse peut galement tre ralise en 2 tapes, sur 2 jours conscutifs, sous rserve dassurer lbullitiondouce pendant 16 19 h.Lhydrolyse en bloc thermostat doit se faire s
32、ous hotte, et le tube ou le ballon doit tre coiff dun rfrigrant airou eau. Pour une hydrolyse en tuve (acide sulfurique uniquement) les ballons sont coiffs dun verre de montre.9.3 Ajustement et filtration Si le ballon ou le tube dhydrolyse (6.2) est jaug, laisser refroidir temprature ambiante puis a
33、juster avec leauet agiter.Sinon transvaser chaud quantitativement dans une fiole jauge de V0ml, rincer leau chaude, refroidir et ajus-ter avec de leau, agiter.Filtrer (filtre 5.9).Lchantillon filtr peut se conserver en fiole hermtiquement ferme, une semaine une temprature infrieure+8C.Lchantillon fi
34、ltr peut tre dilu au 1/20eou au 1/50e. Soit D, cette dilution exprime sous la forme 0,05 pour ladilution au 1/20e, 0,02 pour la dilution au 1/50e.La concentration finale doit permettre une mesure dans la partie linaire de la courbe dtalonnage duparagraphe 5.6.NF V 04-415 8 9.4 Dveloppement de la col
35、oration et mesure de labsorbance9.4.1 Introduire dans un tube essai :5 ml 0,1 ml de lhydrolysat filtr, ventuellement dilu, correspondant une quantit en L(-)hydroxyprolinecomprise entre 2,5 g et 10 g ;2,5 ml 0,1 ml respectivement de ractif la chloramine T (5.4).Mlanger et laisser 20 min 1 min la temp
36、rature ambiante.9.4.2 Ajouter 2,5 ml 0,1 ml respectivement de ractif colorimtrique (5.5), coiffer le tube avec un morceaudaluminium ou de plastique ou un bouchon, mlanger.NOTE La quantit dhydrolysat indique en 9.4.1 peut tre diffrente, les quantits des ractifs ajoutes en 9.4.1 et 9.4.2doivent tre mo
37、difies en proportion.9.4.3 Porter rapidement le tube dans le bain deau (6.4) pralablement rgl 60 C 2 C et, chaufferpendant 20 min 1min.9.4.4 Refroidir sous un courant deau froide ou, dans un bain deau, pendant au moins 3 min, et laisser tem-prature ambiante pendant 30 min.9.4.5 Mesurer labsorbance 5
38、58 nm 2 nm par rapport leau au moyen du spectrophotomtre ou ducolorimtre (6.5).9.4.6 Lire la concentration en L(-)hydroxyproline de lhydrolysat, ventuellement dilu, sur la courbe dtalon-nage ou, la calculer par rgression linaire. Soit C cette quantit exprime en g/ml.9.5 Courbe dtalonnageEffectuer le
39、s oprations dcrites en 9.4, en remplaant lhydrolysat par le mme volume de chacune des solutionstalons de L(-)hydroxyproline et, pour lessai blanc, par le mme volume deau.Prendre en compte les valeurs des absorbances mesures en fonction des concentrations correspondantes dessolutions talons pour le c
40、alcul de la concentration des chantillons.9.6 Calculo : V0est le volume de lhydrolysat avant filtration (9.3) ;C est la concentration calcule en (9.4.6) ;m est la masse de la prise dessai (9.1) ;D est la dilution (9.3).Exprimer le rsultat avec 2 dcimales :Si le rsultat est exprim en % en masse de co
41、llagne, le coefficient utilis est, conventionnellement, 8, et lersultat est exprim avec 1 dcimale.Teneur en L(-)hydroxyproline, exprime en % en masseCV010 000 D m-= 9 NF V 04-41510 FidlitGnralitsLes protocoles des essais interlaboratoires portant sur la mthode sont rsums dans lannexe A.RptabilitLa d
42、iffrence absolue entre deux rsultats individuels indpendants, obtenus laide de la mme mthode sur unmatriau identique soumis lessai dans le mme laboratoire, par le mme oprateur utilisant le mme appa-reillage et, dans lintervalle de temps le plus court, ne dpassera pas la valeur de rptabilit r dans pl
43、us de 5 %des cas.Les valeurs issues des essais interlaboratoires sont largies aux matrices suivantes :en collagne :1) pices cuites m = 0,7 % r = 0,2 %2) pt pte htrogne m = 2,2 % r = 0,2 %3) pt pte homogne, pt de foie m = 1,9 % r = 0,2 %4) saucisses/saucissons cuits, cervelas, mortadelle m = 2,7 % r
44、= 0,3 %5) saucisses/ saucissons secs m = 2,4 % r = 0,5 %6) saucisses/saucissons crus m = 1,6 % r = 0,7 %ReproductibilitLa diffrence absolue entre deux rsultats individuels, obtenus laide de la mme mthode sur un matriau iden-tique soumis lessai dans des laboratoires diffrents par des oprateurs diffre
45、nts utilisant des appareillages dif-frents, ne dpassera pas la valeur de reproductibilit R, dans plus de 5 % des cas.Les valeurs issues des essais interlaboratoires sont largies aux matrices suivantes :en collagne :1) pices cuites m = 0,7 % R = 0,4 %2) pt pte htrogne m = 2,2 % R = 0,6 %3) pt pte hom
46、ogne m = 1,9 % R = 0,6 %4) saucisses/saucissons cuits, cervelas, mortadelle m = 2,7 % R = 0,6 %5) saucisses/ saucissons secs m = 2,4 % R = 1,0 %6) saucisses/saucissons crus m = 1,6 % R = 1,0 %11 Rapport danalyseLe rapport dessai doit indiquer : tous les renseignements ncessaires lidentification comp
47、lte de lchantillon ; la mthode utilise, avec la rfrence la prsente norme ; le(s) rsultat(s) dessai obtenu(s), en indiquant, la teneur en L(-)hydroxyproline, et/ou la teneur en collagne etle facteur de conversion utilis (8) ; tous les dtails opratoires non prvus dans la prsente norme ; les incidents ventuels susceptibles davoir agi sur le(s) rsultat(s).12 Dosage flux continuToutes les tapes de colorimtrie
