1、 ICS 07.080 VDI-RICHTLINIEN August 2013 VEREIN DEUTSCHER INGENIEURE Monitoring der Wirkungen gentechnisch vernderter Organismen (GVO) Verfahren zur Extraktion von Nukleinsuren aus Bden zur Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften und zum Nachweis transgener DNA Qualittsanforderungen und Anwendungsbei
2、spiele Monitoring the effects of genetically modified organisms (GMOs) Method for extracting nucleic acids from soil for the analysis of microbial communities and for detection of transgenic DNA Quality requirements and applications VDI 4331 Blatt 2 / Part 2 Ausg. deutsch/englisch Issue German/Engli
3、sh Die deutsche Version dieser Richtlinie ist verbindlich. The German version of this standard shall be taken as authori-tative. No guarantee can be given with respect to the English translation. VDI-Gesellschaft Technologies of Life Sciences (TLS) Fachbereich Gentechnik VDI-Handbuch GVO-Monitoring
4、Vervielfltigungauch fr innerbetrieblicheZweckenichtgestattet/Reproduction even for internalusenotpermittedFrhereAusgabe:VDI4331Blatt7:2011-11 EntwurfFormeredition:VDI4331Part7:2011-11 DraftZubeziehendurch/ AvailableatBeuthVerlagGmbH,10772BerlinAlleRechtevorbehalten/ All rightsreservedVereinDeutscher
5、Ingenieuree.V.,Dsseldorf2013Inhalt Seite Contents Page Vorbemerkung . 2 Einleitung . 2 1 Anwendungsbereich . 7 2 Normative Verweise 8 3 Begriffe 9 4 Qualittsanforderungen fr Nukleinsureextrakte 10 5 Materialliste . 12 5.1 Gerte und Ausrstung. 12 5.2 Reagenzien . 12 6 Durchfhrung 13 6.1 Probenahme .
6、13 6.2 Transport, Aufarbeitung und Lagerung der Proben 13 6.3 Extraktion von Nukleinsuren aus Bodenproben 14 6.4 Qualittsanalysen der Nukleinsuren . 17 6.5 Molekularbiologische Analysen und ihre Nachweisgrenzen 18 Anhang A DNA-Extraktion aus Bodenproben 20 Anhang B Spezielle Anpassung fr die DNA-Ext
7、raktion aus Bden mit hohen Huminstoffgehalten . 23 Anhang C Gleichzeitige Extraktion von DNA und RNA aus Bodenproben 24 Schrifttum 27 Preliminary note . 2 Introduction 2 1 Scope . 7 2 Normative references . 8 3 Terms and definitions 9 4 Quality requirements for nucleic acid extracts 10 5 List of mat
8、erials 12 5.1 Apparatuses, instruments, equipments . 12 5.2 Reagents . 12 6 Procedure 13 6.1 Sampling 13 6.2 Transportation, preparation and storage of samples 13 6.3 Extraction of nucleic acids from soil samples 14 6.4 Quality assessment . 17 6.5 Molecular-biological analysis techniques and their d
9、etection limits 18 Annex A Protocol for DNA extraction from soil samples 20 Annex B Special modification of a protocol for DNA extraction from soils with a higher amount of humic material 23 Annex C Protocol for simultaneous extraction of DNA and RNA from soil samples 24 Bibliography 27 B55EB1B3E14C
10、22109E918E8EA43EDB30F09DCDB7EF87D9NormCD - Stand 2013-09 2 VDI 4331 Blatt 2 / Part 2 Alle Rechte vorbehalten Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2013 Vorbemerkung Der Inhalt dieser Richtlinie ist entstanden unter Beachtung der Vorgaben und Empfehlungen der Richtlinie VDI 1000. Alle Rechte, i
11、nsbesondere die des Nachdrucks, der Fotokopie, der elektronischen Verwendung und der bersetzung, jeweils auszugsweise oder vollstn-dig, sind vorbehalten. Die Nutzung dieser VDI-Richtlinie ist unter Wah-rung des Urheberrechts und unter Beachtung der Lizenzbedingungen (www.vdi.de/richtlinien), die in
12、den VDI-Merkblttern geregelt sind, mglich. Allen, die ehrenamtlich an der Erarbeitung dieser VDI-Richtlinie mitgewirkt haben, sei gedankt. Eine Liste der aktuell verfgbaren Bltter dieser Richtlinienreihe ist im Internet abrufbar unter www.vdi.de/4331. Preliminary note The content of this standard ha
13、s been developed in strict accordance with the requirements and rec-ommendations of the standard VDI 1000. All rights are reserved, including those of reprint-ing, reproduction (photocopying, micro copying), storage in data processing systems and translation, either of the full text or of extracts.
14、The use of this standard without infringement of copyright is permitted subject to the licensing con-ditions specified in the VDI Notices (www.vdi.de/ richtlinien). We wish to express our gratitude to all honorary contributors to this standard. A catalogue of all available parts of this series of st
15、andards can be accessed on the internet at www.vdi.de/4331. Einleitung Bden sind typischerweise durch eine groe Viel-falt unterschiedlicher Mikroorganismen (Bakterien, Archaeen, Pilze, Protozoen) gekennzeichnet. Mikrobielle Gemeinschaften liefern durch ihre Stoffwechselaktivitten einen wichtigen Bei
16、trag zu kosystemaren Funktionen und zur nachhaltigen Nutzung von Bden. Auerdem sind sie fr Pflan-zenwachstum und -gesundheit von groer Bedeu-tung. In ihrer Zusammensetzung reagieren mikro-bielle Gemeinschaften auf verschiedene abiotische und biotische Umweltfaktoren, wodurch sich n-derungen in ihren
17、 Funktionen ergeben knnen. Vernderungen der mikrobiellen Gemeinschaften knnen daher unter Umstnden auch kologische und konomische Schden herbeifhren. Diese knnen auf der Ebene von biogeochemischen Kreis-lufen liegen (z. B. durch erhhte Emissionen von Treibhausgasen, wie Methan oder Stickoxiden) oder
18、 in der Anreicherung von pflanzen-, tier- und humanpathogenen Mikroorganismen bestehen. Introduction Soil typically contains a high diversity of microor-ganisms (bacteria, archaea, fungi, protozoa). Such microbial communities make a significant contri-bution to ecosystem processes and sustainable so
19、il use through their metabolic activities. They are also very important for plant growth and health. Microbial communities can change their composi-tion in response to various abiotic and biotic envi-ronmental factors, which may also result in func-tional changes. In some circumstances, changes to m
20、icrobial communities may also result in ecologi-cal and economic damage. This may occur at the level of biogeochemical cycles (e.g. due to in-creased emissions of greenhouse gases such as methane or nitrogen oxides) or by increasing the presence of plant, animal and human pathogens. Da eine Vernderu
21、ng per se nicht als negativ ge-wertet werden kann, mssen mgliche Effekte von definierten Einflussfaktoren (z. B. gentechnisch ver-nderten Organismen (GVO), Bodenbearbeitungen, Pflanzenschutzmitteln, organischen Schadstoffen, Schwermetallen) auf die mikrobielle Gemeinschaft von ihrer natrlichen Dynam
22、ik abgegrenzt werden. Ebenso kann das Ausma einer Vernderung in der Zusammensetzung einer mikrobiellen Gemein-schaft nicht direkt mit dem Ausma eines Scha-dens korreliert werden, da natrliche Schwankun-gen, z. B. im Wassergehalt eines Bodens oder durch die kurzfristige Verfgbarkeit von Nhrstof-fen,
23、z. B. nach einer Dngung, erhebliche Ver-schiebungen der mikrobiellen Vielfalt hervorrufen Since a change in the microbial community struc-ture cannot be interpreted as negative per se, the possible effects of defined triggers (e.g. genetically modified organisms (GMOs), soil cultivation, pes-ticides
24、, organic pollutants, heavy metals) must be seen in relation to their natural dynamics. Equally, the extent of change in the composition of a mi-crobial community does not directly translate to the degree of damage, since natural fluctuations, e.g., in the water content of the soil or due to the sho
25、rt-term availability of nutrients after fertilizing, can cause significant fluctuations in microbial di-versity. The persistence of changes in microbial diversity (e.g., over a period of several years) pro-vides a much better indicator of damage. Variabil-B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCDB7EF87
26、D9NormCD - Stand 2013-09All rights reserved Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2013 VDI 4331 Blatt 2 / Part 2 3 knnen. Zur Schadensindikation ist vielmehr das Andauern einer Vernderung der mikrobiellen Vielfalt z. B. ber einen mehrjhrigen Zeitraum zu bercksichtigen. Die Vernderlichkeit in d
27、er Zu-sammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft hat auch Konsequenzen fr die Probenahme, z. B. soll-ten Bodenproben nicht unmittelbar nach Dngungs-ereignissen genommen werden (Abschnitt 6.1 und Abschnitt 6.2). ity in the composition of microbial communities has also practical consequences when it
28、comes to developing soil sampling strategies, e.g., soil sam-ples should not be taken immediately after soil fertilization (Section 6.1 and Section 6.2). Im Rahmen dieser VDI-Richtlinie werden Grund-prinzipien erlutert und Beispielprotokolle zur Extraktion von Nukleinsuren aus Bden gegeben. Nukleins
29、uren beinhalten DNA und RNA. Beispie-le fr Protokolle, mit denen entweder DNA oder kombiniert DNA und RNA aus Bodenproben ex-trahiert und gereinigt werden knnen, werden im Anhang zu dieser Richtlinie gegeben. Diese Richt-line spezifiziert nicht die nach Extraktion und Rei-nigung folgenden analytisch
30、en Methoden zur qua-litativen oder quantitativen Untersuchung von mikrobiellen Gemeinschaften oder Nachweisen von Transgenen aus GVO im Detail (z. B. PCR-Primer und PCR-Bedingungen, siehe hierzu VDI 4330 Blatt 7). Derartige Informationen zu spe-zifischen Anwendungen sollten der aktuellen Lite-ratur
31、entnommen werden. Mglicherweise sind jedoch auch das Design neuer Primer sowie die Anpassung der PCR-Bedingungen notwendig. This VDI Standard explains the basic principles and provides sample protocols for the extraction of nucleic acids from soil. Nucleic acids include DNA and RNA. Examples for pro
32、tocols for extracting either DNA or combined DNA and RNA are given in the Annex of this document. This VDI Standard does not specify subsequent detection methods (e.g. PCR primers and conditions, for this purpose see VDI 4330 Part 7) to quantitatively and qualita-tively characterize microbial commun
33、ities or detect recombinant genes (transgenes) of GMOs from soil. Information on such specific purposes should be taken from the relevant literature or, if not available, require the development of new primers and adapted protocols, for which recommendations would go beyond the scope of this standar
34、d. Protokolle zur Extraktion von Nukleinsuren aus Bodenproben wurden erstmals Ende der 1980er- Jahre publiziert und werden seitdem zunehmend in Forschungslaboratorien eingesetzt. Extrahierte Nu-kleinsuren stammen im Wesentlichen aus Bo-denmikroorganismen, knnen aber auch pflanzli-chen oder, in einem
35、 geringeren Ma tierischen Ursprungs sein. Die Nukleinsuren dienen als Ausgangsmaterial zum Nachweis von Mikroorga-nismen und zur Ermittlung ihrer Vielfalt. Zustz-lich knnen die Nukleinsuren auch zum Nachweis pflanzlicher Gene genutzt werden, um z. B. trans-gene DNA (rekombinante Gene) aus gentechnis
36、ch vernderten Pflanzen zu detektieren, z. B. aus deren Wurzeln oder Blatt- und Stngelresten im Boden. Die Nachweise der jeweiligen Zielgene, sei es fr die Charakterisierung der mikrobiellen Vielfalt oder fr den GVO-Nachweis, erfolgt dabei vor allem mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus de
37、n bodenextrahierten Nukleinsuren. Aktuelle Forschungsarbeiten in diesem Gebiet fhren dazu, dass stndig neue, verbesserte Nach-weisverfahren fr bestimmte Zielgene publiziert werden. Daher wird empfohlen, die aktuelle Litera-tur fr die Auswahl eines spezifischen Nachweis-verfahrens unbedingt zu berprf
38、en, um z. B. ge-eignete Primer fr die PCR oder Gensonden Protocols for nucleic acid extractions from soil were first published in the late 1980s and have since been used increasingly in research laborato-ries. Nucleic acids extracted from soil are largely derived from microbial cells, but they may a
39、lso originate from plant material or, to a lower extend, animal residues. Soil nucleic acids provide the source material for detecting microorganisms and determining their diversity but they can also be used to detect genes from plant root cells or plant residues, for example transgenic DNA (recombi
40、-nant genes) from genetically modified plants. For the purposes of detecting specific target genes, either to characterise microbial diversity or detect transgenes from GMOs, the nucleic acids extrac-tions from soil focus on DNA which is then typi-cally subjected to polymerase chain reactions (PCR)
41、for amplification of target genes. Ongoing research in this field frequently updates and im-proves existing detection systems and therefore, studies on specific target genes should always con-sider the most recent literature for designing the appropriate analytical tools, i.e. primers or Taqman prob
42、es (see Section 6.5). B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCDB7EF87D9NormCD - Stand 2013-09 4 VDI 4331 Blatt 2 / Part 2 Alle Rechte vorbehalten Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2013 (Taqman-Sonden fr die qPCR, siehe Ab-schnitt 6.5) auszuwhlen. Kultivierungsunabhngige Verfahren zur Charak-t
43、erisierung der mikrobiellen Vielfalt aus Boden-proben sind in jedem Fall den klassischen Verfah-ren vorzuziehen, die sich durch Anreicherung von Mikroorganismen auf Nhrbden auszeichnen. Nur ein geringer Anteil der Bodenmikroorganismen, hufig weniger als 1 %, ist zum Wachstum unter herkmmlichen Labor
44、bedingungen befhigt. Die groen Potenziale der kultivierungsunabhngigen Nachweismethoden zeigen jedoch auch deutlich die allgemeinen Limitierungen, wenn es um die Ermittlung der tatschlichen mikrobiellen Vielfalt in Bden geht. Die natrliche Vielfalt einer mikro-biellen Gemeinschaft im Boden ist so gr
45、o, dass sie mit einer praktikablen Monitoring-Methode bis heute nicht z. B. nicht einmal aus einem Gramm Boden vollstndig erfasst werden kann. Insbe-sondere der Nachweis von Mikroorganismen, die nicht zu den dominanten Populationen gehren, ist problematisch und bleibt eine methodische Heraus-forderu
46、ng. Vielversprechend fr den Nachweis dieser seltenen Mikroorganismen einer Gemein-schaft sind neue Hochdurchsatz-DNA-Sequen-zierungsverfahren 11. Im Rahmen dieser Richtli-nie werden Verfahren vorgestellt, die es ermgli-chen, die dominanten Bodenmikroorganismen so-wie ausgewhlte phylogenetische, also
47、 eng ver-wandte Gruppen, zu erfassen (Abschnitt 6.5). Eine weitere fr die Dateninterpretation zu bercksich-tigende Limitierung besteht darin, dass die aus einem Boden extrahierten Nukleinsuren, insbe-sondere die DNA, auch aus ruhenden oder bereits abgestorbenen Zellen stammen knnen und somit ein Nac
48、hweis bestimmter Organismen aus einer Bodenprobe nicht automatisch einen Hinweis auf ihre In-situ-Aktivitt ist. Auerdem bedeutet der Nachweis von Genen auf DNA-Ebene nicht unbe-dingt, dass diese Gene unter den gegebenen Bedin-gungen des Bodens auch angeschaltet“ sind, das heit, der Nachweis eines Ge
49、ns ist noch kein Nachweis seiner Aktivitt. Cultivation-independent approaches for character-izing microbial diversity from soil samples are always preferred to classic methods in which mi-croorganisms are grown in or on cultivation media in the laboratory. Only a minor fraction of soil microorganisms, typically less than 1 %, is capable of growing under commonly applied conditions for cultivation. However, the significant potential of culti
