1、1考点 80 PCR 技术 1PCR 原理（1）细胞内 DNA 复制条件条件 组分 作用模板 DNA 的两条单链 提供复制的模板原料 四种脱氧核苷酸 合成 DNA 子链的原料酶解旋酶DNA 聚合酶打开 DNA 双螺旋催化合成 DNA 子链能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能引物 RNA为 DNA 聚合酶提供合成的 3端起点（2）细胞内 DNA 复制过程DNA 的两条链是反向平行的，通常将 DNA 的羟基末端称为 3端，而磷酸基团的末端称为 5端。DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从 3端延伸 DNA链，因此，DNA 复制需要引物。DNA 的合成方向总是从子链的 5端向 3端延伸。在
2、 DNA 的复制过程中，复制的前提是双链解开。在体外可通过控制温度来实现。在 80100 的温度范围内，DNA 的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于 PCR 过程的温度高，导致 DNA 聚合酶失活，后来耐高温的 DNA 聚合酶的发现和应用，大大增加了 PCR 的效率。PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供：DNA 模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的 DNA 聚合酶，同时通过控制温度使 DNA 复制在体外反复进行。22PCR 的反应过程PCR 一般要经历三十多次循环，每次
3、循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的 DNA 单链会与引物结合，进行 DNA 的延伸，这样，DNA 聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的 DNA 序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。3实验操作（1）PCR 反应体系：缓冲液、DNA 模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定的 DNA 聚合酶、两种 RNA 引物、水。（2）实验操作步骤按照 PCR 反应体系配方配制反应液；将 PCR 反应体系 50L 用微量移液器转移到微量离心管（0.5 mL）中；将微量离心管放到 PCR 仪中；设置 PCR 仪的工作参数；DNA 在 PCR 仪
4、中大量扩增。考向 PCR 的反应过程1聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术。PCR 过程一般经历下述 30多次循环：95 下使模板 DNA 变性、解链55 下复性(引物与 DNA 模板链结合)72 下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关 PCR 过程的叙述中不正确的是A变性过程中破坏的是 DNA 分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B复性过程中引物与 DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的C延伸过程中需要 DNA 聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸DPCR 与细胞内 DNA 复制相比所需酶的最适温度较高3【参考答案】C【试题解析】变性过程中破坏的是
5、 DNA 分子内碱基对之间的氢键，解旋酶也具有该作用，A 正确。复性过程中引物与 DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，B 正确。延伸是合成 DNA 的过程，所以该过程中需要 DNA 聚合酶、ATP、四种脱氧核糖核苷酸，C 错误。PCR 与细胞内 DNA 复制相比所需酶的最适温度较高，因为 PCR 过程需要高温变性，即使在复性时的温度也比较高，D 正确。2利用 PCR 技术扩增目的基因，其原理与细胞内 DNA 复制类似（如下图所示）。图中引物为单链 DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是A用 PCR 方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列B设计引物时需要避免引物之
6、间形成碱基互补配对而造成引物自连C退火温度过高可能导致 PCR 反应得不到任何扩增产物D第四轮循环产物中同时含有引物 A 和引物 B 的 DNA 片段所占的比例为 15/16【答案】D41PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的 DNA 片段的核酸合成技术，如图表示合成过程。下列说法错误的是A甲过程高温使 DNA 变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用B丙过程用到的酶在高温下失活，因此在 PCR 扩增时需要再添加C如果把模板 DNA 的两条链用 15N 标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，循环 3 次后，在形成的子代 DNA 中含有 15N 标记的 DNA 占 25%DPCR 中由碱基错
7、配引起的变异属于基因突变2下列有关 PCR 技术中引物的叙述，正确的是A引物是一小段 DNA 分子或双链 RNA 分子B扩增一个 DNA 分子至少需要的引物数目等于新合成的 DNA 子链数目C两种引物之间能够发生碱基互补配对DDNA 聚合酶只能从引物的 5端连接脱氧核苷酸3利用 PCR 技术将某 DNA 分子扩增 n 代的过程中，下列叙述错误的是A引物越短，PCR 出来的非目标 DNA 就越多B适温延伸过程中，需要提供 ATPC引物中 G/C 含量越高，退火温度越高D共有 2n-1 对引物参与子代 DNA 分子的合成4多聚酶链式反应(PCR 技术)是体外酶促合成特异性 DNA 片段的一种方法，
8、其简要过程如图所示。下列关于 PCR 技术叙述不正确的是5APCR 技术是在实验室中以少量 DNA 制备大量 DNA 的技术B反应中新合成的 DNA 可以作为下一轮反应的模板C每扩增一次温度发生 907555变化D应用 PCR 技术与 DNA 分子杂交技术可以检测基因突变5小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因（目的基因）后再重组表达。下列相关叙述正确的是A设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列B用 PCR 方法扩增目的基因时需要知道基因的全部序列CPCR 体系中 GC 碱基对含量将影响使 DNA 解链的所需温度DPC
9、R 体系中一定要添加从受体细胞中提取的 DNA 聚合酶6用 PCR 技术将 DNA 分子中的 A1片段进行扩增，设计了引物、，其连接部位如图所示，x 为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分 DNA 片段是图中的A BC D7用 PCR 方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱。其中：1 号为 DNA 标准样液（Marker），10 号为蒸馏水，PCR 过程中加入的模板 DNA 如图所示。据此作出的分析不合理的是6APCR 产物的分子大小在 250500 bp 之间B3 号样品为不含目的基因的载体 DNAC9 号样品对应植株不是所需的转基因植株D10 号可确定反应体系等对结果
10、没有干扰8根据某基因上游和下游的碱基序列，设计合成了用于该基因 PCR 的两段引物（单链 DNA)。引物与该基因变性 DNA(单链 DNA)结合为双链 DNA 的过程称为复性。下图是两引物的Tm（引物熔解温度，即 50%的引物与其互补序列形成双链 DNA 分子时的温度）测定结果，下列叙述错误的是A通常引物 1 和引物 2 不能有碱基互补配对关系B两引物分别是子链延伸的起点，并可以反复利用C若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物 2 的 GC 含量较高D复性所需温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度等因素9以下为形成 cDNA 过程和 PCR 扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是A过
11、程发生的变化是引物与单链 DNA 结合B催化过程的酶是 DNA 聚合酶C催化过程的酶都必须能耐高温7D过程需要解旋酶10在遗传病及刑侦破案中常需要对样品 DNA 进行分析，PCR 技术能快速扩增 DNA 片段，在几个小时内复制出上百万份的 DNA 拷贝，有效地解决了因为样品中 DNA 含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题。（1）在相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物置于合适的位置。_。（2）在相应的横线上写出循环一次后生成的 DNA 分子。_。（3）若将作为原料的四种脱氧核苷酸用 32P 标记，请分析循环一次后生成的 DNA 分子的特点：_，循环 n 次后生成的
12、DNA 分子中不含放射性的单链占总单链的比例为_。（4）PCR 反应过程的前提条件是_，PCR 技术利用了 DNA 的_原理解决了这个问题。（5）在对样品 DNA 分析过程中发现，DNA 掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是_。11（2018江苏卷）为生产具有特定性能的 -淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了 -淀粉酶基因（1656 个碱基对），利用基因工程大量制备琢 -淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：8（1）利用 PCR 技术扩增 -淀粉酶基因前，需先获得细菌的。（2）为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不
13、同的限制性酶切位点，主要目的是。（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中的设定与引物有关，的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）变性温度 退火温度 延伸温度 变性时间 退火时间 延伸时间（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码 -淀粉酶的 mRNA 的部分碱基序列：图中虚线框内 mRNA 片段包含个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有种。（5）获得工程菌表达的 -淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为 1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：缓冲液 50 mmol/LNa2HPO4-KH2PO4 50 mmol/LTris-HCl 50
14、 mmol/LGly-NaOHpH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5酶相对活性%25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8根据上述实验结果，初步判断该 -淀粉酶活性最高的条件为。12 (2016天津卷)人血清白蛋白(HSA) 具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下9图是以基因工程技术获取重组 HSA（rHSA）的两条途径。（1）获取 HSA 基因，首先需采集人的血液，提取_合成总 cDNA，然后以cDNA 为模板，采用 PCR 技术扩增 HSA 基因
15、。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达 rHSA 的载体，需要选择的启动子是_（填写字母，单选）。A人血细胞启动子 B水稻胚乳细胞启动子 C大肠杆菌启动子 D农杆菌启动子 （3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是_。（4）人体合成的初始 HSA 多肽，需要经过膜系统加工形成正确空间结构才能有活性。与途径 II 相比，选择途径 I 获取 rHSA 的优势是_。（5）为证明 rHSA 具有医用价值，须确认 rHSA 与_的生物学功能一致。1【答案】
16、B【解析】PCR 中解旋是通过高温进行的，故甲过程高温使 DNA 变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用，A 正确；丙过程用到的酶为耐高温的 DNA 聚合酶，在高温下不会失活，因此在 PCR 扩增时不需要再添加，B 错误；如果把模板 DNA 的两条链用 15N 标记，游离10的脱氧核苷酸不做标记，循环 3 次后，形成的 DNA 分子为 8 个，而含有 15N 标记的 DNA分子为 2 个，故在形成的子代 DNA 中含有 15N 标记的 DNA 占 25%，C 正确；PCR 中由碱基错配引起的变异属于基因突变，D 正确。2【答案】B3【答案】B【解析】引物越短，PCR 出来的非目标 DNA 就越多，
17、A 正确；适温延伸过程中，不需要提供 ATP，B 错误；引物中 G/C 含量越高，则 DNA 模板中 G/C 的含量也高，高温变性的温度就越高，退火温度也越高，C 正确；PCR 技术的原理是 DNA 复制，根据 DNA 分子半保留复制特点可知，共有 2n-1 对引物参与子代 DNA 分子的合成，D 正确。4【答案】C【解析】PCR 技术是一项在生物体外复制特定 DNA 的核酸合成技术，能以少量 DNA 为模板，在短时间内复制出大量的 DNA，A 正确；PCR 技术需要模板 DNA，且反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，B 正确；每扩增一次温度发生 955572变化，C 错误；应用
18、 PCR 技术与 DNA 分子杂交技术可以检测基因突变，D 正确。5【答案】C【解析】设计扩增目的基因的引物时，要考虑表达载体相关序列，从而保证目的的基因能与表达载体相连接及正常表达，A 错误；用 PCR 方法扩增目的基因的前提是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，因此不需要知道基因的全部序列，B 错误；在每个双链 DNA 分子中，碱基对 A 与 T 之间有 2 个氢键，C 与 G 之间有 3 个氢键，且 DNA 分子含有的氢键数越多，其热稳定性就越高，因此 PCR 体系中 GC 碱基对含量将影响使 DNA 解链的所需温度，C 正确；PCR 体系中一定要添加耐高温的热
19、稳定 DNA 聚合酶，而从受体细胞内提取的 DNA 聚合酶不耐高温，D 错误。6【答案】D【解析】利用 PCR 技术将 DNA 分子中的 A1片段进行扩增，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸的方向总是从 5端到 3端，据此依题意和图示分析可知，11A、B、C 均错误，D 正确。7【答案】B8【答案】B【解析】通常引物 1 和引物 2 不能有碱基互补配对关系，以免二者结合，A 项正确；两引物参与构成子链，不能反复利用，B 项错误；若两引物的脱氧核苷酸数相同，引物 2的熔解温度较高，推测其 GC 含量较高，C 项正确；结合以上分析可知，复性所需温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓
20、度等因素，D 项正确。9【答案】A【解析】分析题图：图示为形成 cDNA 过程和 PCR 扩增过程示意图，其中是由 RNA 形成单链 DNA 的过程，为逆转录过程；是由单链 DNA 合成双链 DNA 的过程，是 DNA 分子复制过程；是多聚酶链式反应扩增 DNA 片段，其中是变性、是复性、是延伸阶段。为复性过程，发生的变化是引物与互补 DNA 链结合，A 正确；为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化，B 错误；图中过程为 DNA 复制，这两个过程都需要 DNA 聚合酶的催化，其中过程进行的温度是 7075，因此催化该过程的 DNA 聚合酶能耐高温，但催化过程的酶不耐高温，C 错误；过程为高温解
21、链，该过程不需要解旋酶，D 错误。10【答案】（1）5GAOH(或 HOAG5) （2）（3）每个 DNA 分子各有一条链含 32P 1/2n（4）DNA 解旋 热变性12（5）蛋白酶【解析】（1）由图可知，引物为 5-G-A-OH。（2）循环一次后生成的 DNA 分子如下： 。（3）若将作为原料的四种脱氧核苷酸用 32P 标记，根据 DNA 半保留复制特点可知，循环一次后，每个 DNA 分子各有一条链含 32P，循环 n 次后生成的 DNA 分子中不含放射性的单链占总单链的比例为2/2n+1=1/2n。（4）PCR 反应过程的前提条件是 DNA 解旋，PCR 技术利用 DNA 的热变性原理解决了这个问题。（5）在对样品 DNA 进行分析的过程中发现，DNA 掺杂着一些组蛋白，根据酶的专一性原理，要去除这些组蛋白可加入蛋白酶。11【答案】（1）基因组 DNA（2）5 使 DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连（3） （4）8 13（5）pH 为 8.5，缓冲液为 50mmol/LTris-HCl12【答案】（1）总 RNA（或 mRNA）13（2）B（3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始 rHSA 多肽进行高效加工（5）HSA
