1、 、ICS 65.120 B 46 备案号： 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21 DB21/T 1688 2008 生鲜蛋中三聚氰胺的测定 Determination of Melamine in Table Eggs 2008-11-19 发布 2008-12-01 实施 辽宁省质量技术监督局 发布 DB21/T 1688 2008 I 前 言 本标准由辽宁省动物卫生监督管理局提出并归口。 本标准由辽宁省质量技术监督局发布。 本标准附录 A为资料性附录。 本标准负责起草单位：农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心（沈阳）。 本标准起草人：刘敬先 张建勋 刘全 刘凯 王淑芬 杨希国 于家
2、丰 王丽娜 田晓玲 曲韵坤。 本标准首次发布。 DB21/T 1688 2008 1 生鲜蛋中三聚氰胺的测定 1 范围 本标准规定了生鲜蛋中三聚氰胺残留检测的制样和酶联免疫（ ELISA） 、高效液相色谱（ HPLC） 、气相色谱 -质谱法 (GC-MS)测定方法。 本标准适用 于生鲜鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋中三聚氰胺残留检测。 本标准中的酶联免疫法为筛选方法，筛选结果为阳性的样品需要用仲裁法确证，高效液相色谱法和气相色谱 -质谱法为定量方法，其中气相色谱 -质谱法为仲裁法。酶联免疫法定量限为 0.20mg/kg，高效液相色谱法定量限为 0.20mg/kg，气相色谱 -质谱法定量限为 0.10mg/k
3、g。 2 规范性引用文件 下列文件的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使 用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法 3 制样 3.1 试样的制备 取适量新鲜的禽蛋，将蛋清和蛋黄搅拌使均匀。 3.2 试样的保存 -20以下贮存。 4 酶联免疫法 4.1 原理 本方法基于酶联免疫法中的竞争性测定法原理，通过样品萃取物中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标记物竞争结合微孔中的三聚氰胺抗体，除去未结合
4、的三聚氰胺酶标记物后，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质，加终止液后在 450nm下读取各微孔吸光度值。吸光度 值 与样品中的三聚氰胺含量成反比。 4.2 试 剂和溶液 4.2.1 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。水应符合 GB/T 6682二级水的规定。 4.2.2 三聚氰胺试剂盒（附系列标准品溶液，酶标记物，清洗液、底物，终止液，说明书）。 4.2.3 正己烷（ C6H14） 4.2.4 10%甲醇 /20mMPBS：称取 0.62gNaH2PO4 H2O， 5.73gNa2HPO4 12H2O和 9gNaCl用蒸馏水溶解，并定容至 1000mL，取此溶液 900mL，加入
5、 100mL甲醇混匀即得。 4.3 仪器和设备 4.3.1 酶标仪（带 450nm 滤光片）。 4.3.2 涡旋混合器。 4.3.3 冷冻离心机。 4.3.4 微量加样器： 20L、 50L、 100L、 150L、 250L。 DB21/T 1688 2008 2 4.3.5 恒温干燥箱。 4.3.6 分析天平：感量 0.01g。 4.3.7 振荡器 4.4 测定步骤 4.4.1 样品处理 准确称量 2g试料（ 3.1）精确到 0.01g，加入 10mL 10%甲醇 /20mMPBS（ 4.2.4），涡旋 30s，振荡 5min，4000r/min离心 5min，取 2mL上清液加入 2mL
6、正己烷（ 4.2.3） ，混匀， 4000r/min离心 5min，静置，取下层 150L待测。 4.4.2 测试程序 取出欲测数量的微孔条安插在酶标板上，分别吸取 0g/L、 20g/L、 100g/L、 250g/L、 500g/L标准溶液（ 4.2.2）和试样萃取液（ 4.4.1）各 150L至包被有三聚氰胺抗体的对应微孔中，分别加入 50L三聚氰胺酶标记物溶液，振荡使混匀， 25左右孵育 30min。倾尽酶标板，清洗液（ 4.2.2）洗板 4次，拍干。加 100L底物（ 4.2.2）至每个微孔中，振荡使混匀， 25左右孵育 30min。加 100L终止液（ 4.2.2）至每个微孔中，振
7、荡混匀， 450nm下读取各微孔吸光度值。 注：不同品牌的试剂盒其操作步骤可能略有差异，比如稀释倍数，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。 试剂盒使用前恢复到室温。 标准和样品做 平行试验以增加准确性。 4.5 结果计算 以空白溶液（浓度为 0的标准溶液）的吸光度值为 100%作为计算基准，折算出各标准溶液和试样萃取液的相对吸光度值。 相对吸光度值（ %） = 绘制标准相对吸光度值与浓度（ g/L） 关系曲线，校正曲线在 20g/L-500g/L范围内为线性。试样萃取液的浓度（ g/L）可以从校正曲线上读出。 5 高效液相色谱法 5.1 原理 试料中的三聚氰胺经三氯乙酸和乙酸铅提取并沉
8、淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性杂质，混合型阳离子交换固相萃取小柱净化，高效液相色谱仪测定，外标法 定量。 5.2 试剂和材料 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。除色谱用水应符合 GB/T 6682一级水的规定外，水应符合 GB/T 6682二级水的规定。 5.2.1 三聚氰胺对照品：含三聚氰胺（ C3H6N6） 不得少于 95.0%。 5.2.2 三氯甲烷（ CHCl3） 。 5.2.3 乙腈 (CH3CN)：色谱纯。 5.2.4 甲醇（ CH3OH） :色谱纯。 5.2.5 庚烷磺酸钠（ C7H15SO3Na）。 5.2.6 柠檬酸（ C6H8O7H2O）。 5.2.7 氨水（ NH3H2
9、O）。 5.2.8 氮气 (N2)：普通氮气。 5.2.9 0.122mol/L 三氯乙酸溶液：准确称取三氯乙酸 20g 于 1000mL 容量瓶中，用水溶 解后定容至刻度。 100空白吸光度值 萃取液吸光度值）标准吸光度值（或试样 （ 1） DB21/T 1688 2008 3 5.2.10 0.058mol/L乙酸铅溶液：准确称取乙酸铅 22g于 1000mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。 5.2.11 20%甲醇溶液：准确量取 20mL甲醇（ 5.2.4）于 100mL容量瓶中，用水定容至刻度。 5.2.12 5%氨化甲醇溶液：准确量取 5mL氨水（ 5.2.7）于 100mL容量瓶中
10、，用甲醇（ 5.2.4）定容至刻度，现用现制。 5.2.13 离子对缓冲溶液：称取 2.02g庚烷磺酸钠（ 5.2.5）和 2.10柠檬酸（ 5.2.6）于 1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。 5.2.14 三聚氰胺标准储备液：精确称取约 50mg三聚氰胺标准品（ 5.2.1），精确到 0.0001g，置 50mL棕色容量瓶中，用 20%甲醇溶液（ 5.2.11）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 1mg/mL 的标准储备液，于 4避光保存。 5.2.15 三聚氰胺标准中间液：用 移液管 准确吸取 5.00mL标准贮备液（ 5.2.14）于 50mL棕色容量瓶中，用 20%甲醇溶液（ 5
11、.2.11）定容至刻度，配成浓度为 100 g/mL的标准中间液。 5.2.16 三聚氰胺标准工作液：分别准确吸取 0.50mL、 1.00mL、 2.50mL、 5.00mL、 10.00mL的标准中间液（ 5.2.15）于 100mL容量瓶中，用 20%甲醇 溶液（ 5.2.11）定容至刻度，配制浓度为 0.50、 1.00、 2.50、5.00、 10.00 g/mL的标准工作液。 5.3 仪器和设备 5.3.1 高效液相色谱仪（配紫外检测器）。 5.3.2 色谱柱： SB-C18或 SB-C8柱。 5.3.3 分析天平：感量 0.0001g。 5.3.4 天平：感量 0.01g。 5.
12、3.5 组织匀浆机。 5.3.6 匀浆杯： 30mL。 5.3.7 离心机 5.3.8 离心管： 50mL。 5.3.9 混合型阳离子交换固相萃取柱： 60mg/3mL。 5.3.10 固相萃取装置。 5.3.11 氮气吹干仪。 5.3.12 涡旋混合器。 5.3.13 振荡器。 5.3.14 微孔滤膜： 0.45 m。 5.4 测定 5.4.1 提取 取（ 2 0.05） g试料（ 3.1），置 50mL离心 管中，依次加入 10mL三氯乙酸溶液（ 5.2.9）、 2mL乙酸铅溶液（ 5.2.10）、 3mL三氯甲烷（ 5.2.2），涡旋 30s使其充分混匀，中速振荡提取 10min， 10
13、000r/min离心 5min，取上清液备用。 5.4.2 净化 依次用 3mL甲醇（ 5.2.4）、 3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱（ 5.3.9），取备用上清液（ 5.4.1）全部过柱，再依次用 3mL水、 3mL甲醇（ 5.2.4）淋洗，抽干。用 5mL氨化甲醇溶液（ 5.2.12）洗脱，收集洗脱液置试管中。于 60下用氮气吹干，加入 1.00mL甲醇溶液（ 5.2.11）于试管中，涡旋 10s，用微孔滤膜（ 5.3.14）过滤，滤液供高效液相色谱仪分析。 5.4.3 测定 5.4.3.1 色谱条件 色谱柱： SB-C18或 SB-C8柱，粒度 5 m， 25cm 4.6mm（
14、ID）。 流动相： 900mL离子对缓冲溶液（ 5.2.13）： 100mL乙腈（ 5.2.3），摇匀。 检测波长： 240nm。 DB21/T 1688 2008 4 柱温： 30。 流速： 1.0mL/min。 进样体积： 20 L。 5.4.3.2 测定 取试样溶液和相应的标准工作液，作单点或多点校准，外标法定量。标准工作液及试样液中三聚氰胺的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。 5.4.4 空白试验 除不加 试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。 5.5 结果计算与表述 试料中三聚氰胺的残留量按式（ 2）计算： X=1000MA 1000VCA s （ 2） 式中： X 试料中三
15、聚氰胺的含量 ,单位为毫克每千克（ mg/kg）； C 标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； A 试样溶液中三聚氰胺的峰面积； As 标准溶液中三聚氰胺的峰面积； M 供试试样质量，单位为克（ g）。 V 试样溶液最终定容体积，单位为毫升（ mL）。 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 5.6 方法灵敏度、准确度、精密度 5.6.1 灵敏度 三聚氰胺在鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋中的定量限为 0.20mg/kg。 5.6.2 准确度 本方法在 0.50mg/kg 10.00mg/kg添加浓度的回收率为 80% 110%。 5.6.3 精密
16、度 本方法的批内变异系数 15%，批间变异系数 20%。 标准溶液色谱图、鸡蛋样品 空白色谱图、鸡蛋样品回收色谱图见附录 A中图 A.1、图 A.2和图 A.3。 6 气相色谱 -质谱法 6.1 原理 试料中残留的三聚氰胺经三氯乙酸和乙酸铅提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性杂质，经混合型阳离子交换固相萃取小柱净化，双三甲基三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷衍生，气相色谱 -质谱仪测定，以m/z327碎片离子色谱峰面积定量。 6.2 试剂和材料 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。水应符合 GB/T 6682二级水的规定。 6.2.1 三聚氰胺对照品：含三聚氰胺（ C3H6N6） 不得少于 95.0%
17、。 6.2.2 三氯甲烷（ CHCl3） 。 6.2.3 乙腈 (CH3CN)：色谱纯。 6.2.4 甲醇（ CH3OH） :色谱纯。 6.2.5 庚烷磺酸钠（ C7H15SO3Na）。 6.2.6 柠檬酸（ C6H8O7H2O）。 6.2.7 氨水（ NH3H2O）。 6.2.8 氮气 (N2)：普通氮气。 DB21/T 1688 2008 5 6.2.9 吡啶 (C5H5N)：优级纯。 6.2.10 双三甲基硅基三氟乙酰胺（ BSTFA） +三甲基氯硅烷 (TMCS)=99:1。 6.2.11 0.122mol/L三氯乙酸溶液：准确称取三氯乙酸 20g于 1000mL容量瓶中，用水溶解后定
18、容至刻度。 6.2.12 0.058mol/L乙酸铅溶液：准确称取乙酸铅 22g于 1000mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。 6.2.13 20%甲醇溶液：准确量取 20mL甲醇（ 6.2.4）于 100mL容量瓶中，用水定容至刻度。 6.2.14 5%氨化甲醇溶液：准确量取 5mL氨水（ 6.2.7）于 100mL容量瓶中，用甲醇（ 6.2.4）定容至刻度，现用现制。 6.2.15 称取 2.02g庚烷磺酸钠（ 6.2.5）和 2.10柠檬酸（ 6.2.6）于 1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。 6.2.16 三聚氰胺标准贮备液：精确称取约 50mg三聚氰胺标准品（ 6.2.1
19、），精确到 0.0001g，用 20%甲醇溶液（ 6.2.13）溶解并定容至刻度，配制成浓度为 1mg/mL的标准储备液，于 4避光保存。 6.2.17 三聚氰胺标准中间液：吸取 5.00mL标准贮备液（ 6.2.16）于 50mL 棕色容量瓶中，用 20%甲醇溶液（ 6.2.13）稀释、定容，配成浓度为 100 g/mL 的标准中间液。 6.2.18 三聚氰胺标准工作液：吸取 1.00mL标准中间液（ 6.2.17）于 100mL容量瓶中， 用甲醇 （ 6.2.4）稀释、定容至浓度为 1.00 g/mL的标准工作液。 6.3 仪器和设备 6.3.1 气相色谱 -质谱仪。 6.3.2 毛细管柱
20、： HP-5MS 毛细管柱 。 6.3.3 分析天平：感量 0.0001g。 6.3.4 天平：感量 0.01g。 6.3.5 组织匀浆机。 6.3.6 匀浆杯： 30mL。 6.3.7 离心机。 6.3.8 离心管： 50mL。 6.3.9 混合型阳离子交换固相萃 取柱： 60mg/3mL。 6.3.10 固相萃取装置。 6.3.11 氮气吹干仪。 6.3.12 涡旋混合器。 6.3.13 振荡器。 6.3.14 微孔滤膜：孔径 0.22 m，有机相。 6.4 测定 6.4.1 提取 取（ 2 0.05） g试料试料（ 3.1），置 50mL离心管中，依次加入 10mL三氯乙酸溶液（ 6.2
21、.11）、 2mL乙酸铅溶液（ 6.2.12）、 3mL三氯甲烷（ 6.2.2），涡旋 30s使其充分混匀，中速振荡提取 10min， 10000r/min离心 5min，取上清液备用。 6.4.2 净化 依次用 3mL甲醇（ 6.2.4）、 3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱（ 6.3.9），取备用上清液（ 6.4.2）全部过柱，再依次用 3mL水、 3mL甲醇（ 6.2.4）淋洗，抽干。用 5mL氨化甲醇溶液（ 6.2.14）洗脱。 6.4.3 衍生化 将洗脱液（或根据洗脱液中三聚氰胺的浓度用甲醇适当稀释）在 60下用氮气吹干，加入 300 L吡啶和 200 L的衍生化试剂（ 6.2.
22、10），涡旋混匀，密封玻璃塞， 70在恒温干燥箱中反应 30min，冷却后用微孔滤膜（ 6.3.14）过滤，滤液用气相色谱 -质谱仪测定。 6.4.4 标准曲线的制备 DB21/T 1688 2008 6 分别准确吸取 1.00 g/mL标准工作液（ 6.2.18） 0.1mL， 0.2mL， 0.3mL， 0.4mL， 0.5mL置具塞小试管，按 6.4.3衍生后，（因试样溶液最终定容体积为 0.5ml，则对应浓度对应分别是 0.2 g/mL， 0.4 g/mL，0.6 g/mL， 0.8 g/mL， 1.0 g/mL）气相色谱 -质谱仪测定。每一个浓度重复测定 2次，测得的峰面积平均值与对
23、应浓度绘制标准曲线，拟合，求得回归方程和相关系数。 6.4.5 测定 6.4.5.1 气相色谱 -质谱条件 色谱柱： HP-5MS毛细管柱或相当者 。 载气：氦气，流速为 1.3mL/min。 进样量： 1 L。 进样口温度： 260。 升温程序：起始温度 75，持续 1.0min,以 30 /min升 温至 300，保持 2.0min。 传输线温度： 280。 运行时间： 10.5min。 扫描范围： 60m/z-400m/z。 扫描模式： 选择离子监测（ SIM） 。监测离子 m/z99、 171、 327、 342，定量离子 m/z327。 离子源： EI源。 离子源温度： 230。 E
24、I源轰击能： 70eV。 6.4.5.2 测定 定性方法：衍生后试样溶液峰与三聚氰胺标准品峰保留时间的相对偏差不大于 0.5%，且四个监测离子丰度比与标准溶液的四个监测离子丰度比一致（即相差在 20%以内），可判断试样中含有三聚氰胺。 定量方法：取 衍生后的标准工作 液及试样溶液，以 m/z327碎片离子色谱峰（基峰）面积积分值 进行单点或多点校准 。 6.4.6 空白试验 除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。 6.5 结果计算与表述 试料中三聚氰胺的残留量按式（ 3）计算： X=1000MA 1000PVCA s （ 3） 式中： X 试料中三聚氰胺的残留量 ,单位为毫克每千克
25、（ mg/kg）； C 标准工作液中三聚氰胺的上机浓度，单位为微克每毫升（ g/mL） ； A 试样溶液中经衍生化三聚氰胺 327碎片离子的峰面积； As 标准工作液中经衍生化三聚氰胺 327碎片离子的峰面积； M 供试试样质量，单位为克（ g）； V 试样溶液最终定容体积，单位为毫升（ mL）； P 稀释倍数。 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 6.6 方法灵敏度、准确度、精密度 6.6.1 灵敏度 三聚氰胺在鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋中的定量限为 0.10mg/kg。 6.6.2 准确度 本方法在 0.20mg/kg 1.00mg/kg添加浓度的回收率为 70% 110%。 6.6.3 精密度 DB21/T 1688 2008 7 本方法的批内变异系数 10%，批间变异系数 15%。 三聚氰胺标准品衍生物选择离子色谱图及对应质谱图、三聚氰胺空白衍生物选择离子色谱图及质谱图、三聚氰胺添加衍生物选择离子色谱图及质谱图、三聚氰胺标准溶液衍生物全扫描质谱图见附录 A中图 A.4 10。DB21/T 1688 2008 1 附录 A (资料性附录 ) DB21/T 1688 2008 2 DB21/T 1688 2008 3 DB21/T 1688 2008 4 DB21/T 1688 2008 5
