1、ICS 65.120 B 46 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 13622011 饲料中氨苯胂酸的测定-高效液相色谱法 Determination of Arsanilic acid in feed High performance liquid chromatography 文稿版次选择2011 - 03 - 16 发布 2011 - 04 - 16 实施安徽省质量技术监督局 发布DB34/T 13622011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省畜牧兽医局提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省兽药饲
2、料监察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。 本标准主要起草人：刘发全、丁在亮、许世富、张莉、蔡东东、刘红云、明文庆。 DB34/T 13622011 1 饲料中氨苯胂酸的测定-高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了以高效液相色谱（HPLC）测定饲料中氨苯胂酸的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中氨苯胂酸的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3
3、 试样制备 按 GB/T 14699.1 采样，选取有代表性的饲料样品 500，四分法缩减至 100，磨碎，全部通过0.42 mm 孔径分析筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。 4 原理 试样中的氨苯胂酸先用甲醇水溶液提取，固相萃取柱净化，用高效液相色谱仪测定，以外标法进行定量分析。 5 试剂和材料 除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。 5.1 氨苯胂酸标准品：纯度 98.0。 5.2 乙腈，色谱纯。 5.3 甲醇，色谱纯。 5.4 甲酸。 5.5 0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液：称取 6.8 g KH 2PO4溶于水中，再用水定容
4、至 1000 mL。 5.6 提取液：甲醇: 水 = 1:1。 5.7 洗脱液:甲醇: 甲酸 = 95:5。 5.8 固相萃取柱：MAX 小柱150 mg/6 mL。 5.9 氨苯胂酸标准贮备液：500 g/mL。准确称取 100mg 氨苯胂酸 标准品(精确至 0.0002 g)于 200 mL棕色容量瓶中，用磷酸二氢钾溶液（5.5）常温超声溶解，定容至刻度并摇匀，配制成标准贮备液，贮于 4 冰箱中，有效期 90 d。 DB34/T 13622011 2 5.10 氨苯胂酸标准工作溶液：分别精确吸取(5.9)中标准贮备液 0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mL 于 100
5、 mL 棕色容量瓶中，用磷酸二氢钾溶液（5.5）定容，配制成 0、2.5、5.0、10、20、50、100 g/mL 标准工作溶液。 5.11 流动相：甲醇：0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液 = 1:9，每 1000 ml 混合液中加 1 mL 甲酸。 5.12 滤膜：0.45 m 有机滤膜。 6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器或紫外检测器。 6.2 分析天平：感量 0.0002 g。 6.3 真空泵(0.1 Mpa)。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 旋转蒸发仪。 6.6 离心机：5000 r/min。 6.7 超声波提取仪。 7 分析步骤 7.1 提取 准确称取
6、适量试样(配合饲料 5 g，浓缩饲料 2 g，复合预混 合饲料 1 g，精确至 0.0002 g)于离心管中，加入甲醇:水溶液（5.6）50 mL，超声提取 30 分钟后， 4000 r/min 离心 10 min，上清液倒入旋转蒸发器中，残渣再用上述提取液（5.6）30 mL，重复上述步骤提取两次，合并上清液，旋转蒸发至 5 mL，转移至 25 mL 棕色容量瓶中，加入磷酸二氢钾溶液（5.5）至刻度，制成备用液。 7.2 净化 先分别用 3 mL 甲醇和 3 mL 水对MAX 小柱进行活化，取 7.1 制成的备用液 3.0 mL 上小柱，控制过柱速度不超过 1.0 mL/min， 用 3 m
7、L 甲醇:甲酸溶液 （5.7） 洗脱， 收集洗脱液过 0.45 m 滤膜(5.12)，上机测定。 7.3 色谱条件 色谱柱：C 18 (4.6250 mm，5 m)，或相当的色谱柱； 检测波长：260 nm； 流速：0.8 mL/min； 进样体积：10 L。 7.4 上机测定 取标准工作液和样品试液分别注入高效液相色谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。 8 结果计算与表述 按照下式计算试样中氨苯胂酸的含量： DB34/T 13622011 3 1000mAs1000VCsAX= (1) 式中： X 试样中氨苯胂酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； A 试样溶液对应的色谱峰面积响应值； As 标准溶液对应的色谱峰面积响应值； V 定容体积，单位为毫升（mL）； Cs 标准溶液的浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； m 试样质量，单位为克（g）。 平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 9 检测方法灵敏度、准确度、精密度 9.1 灵敏度 本方法饲料中氨苯胂酸检测限为 1.0 mg/kg。 9.2 准确度 本方法在添加浓度为 2.0 mg/kg 的回收率为 80120。 9.3 精密度 本方法的批内变异系数 CV10，批间变异系数 CV15。 _
