1、ICS DB51 四川省地方标准 DB51/T 11942011 稻瘟病菌生理小种鉴定技术规范 Rule for Identificating Physiologic Race of Magnaporthe oryzae 2011 - 01 - 25 发布 2011 - 03 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 11942011 I 目 次 前言 II 引言 . III 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 材料和用具 1 4.1 常用仪器及用具 1 4.2 专用器具 2 4.2.1 密闭容器 2 4.3 设施 2 4.4 试剂及培养基 2 4.5 鉴
2、别寄主和对照品种 3 5 鉴定方法 3 5.1 病菌样品采集 3 5.2 病菌产孢 3 5.3 病菌分离 3 5.4 接种体准备 4 5.5 离体叶片制备 4 5.6 接种和保湿 5 5.7 发病调查 5 5.8 重复测定 5 6 生理小种命名： 5 6.1 毒性积分计算： 5 6.2 生理小种鉴定 6 6.3 毒性类型鉴定 6 6.4 新小种鉴定 6 附录A（资料性附录） 稻瘟病菌离体叶片接种发病病情分级标准 7 附录B（资料性附录） 稻瘟病菌生理小种对辅助鉴别寄主的毒性谱和毒性积分表 8 DB51/T 11942011 II 前 言 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标
3、准的附录A、附录B是资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川省农科院植保所、四川省农科院水稻所、四川农业大学、四川省农业厅植保站 本标准主要起草人：彭云良 张梅 谢戎 黄富 姬红丽 张雪梅 章振羽 DB51/T 11942011 III 引 言 水稻稻瘟病，是威胁四川及全国水稻生产的最重要病害，杂交稻在四川推广种植初期，大面积主栽品种遗传背景单一，病菌群体致病性变异后引起的各主栽品种丧失抗性，所造成的病害流行程度和损失远远高于多品种当家的常规稻种植时期。随着市场经济的深入发展和杂交水稻育种技术的普遍掌握，自多恢 1 号选育成功和推
4、广始，四川省杂交稻品种实现了本地化和抗性多样化，四川省稻瘟病发生、流行趋于稳定,但 2002 年后稻瘟病发生面积逐步扩大。选育和利用抗病品种是控制该病害最经济、有效的手段，但病原菌群体毒性变异造成品种抗性丧失，使得抗病品种大面积种植数年后表现感病，是抗病品种选育和利用的最大障碍，因此监测病原菌毒性变异趋势，对于稻瘟病的控制具有重要意义。生理小种指在生物种内或变种内形态上相同,但生理性状上特别是在对不同作物品种的毒性存在显著差异的一类生物型群体。将植物病原菌对特定品种的毒性类型划分成不同的生理小种，进而对病菌生理小种的组成和分布进行鉴定，是病菌毒性变异监测种中最常用的方法。 本规范规定了稻瘟病菌
5、生理小种鉴定的技术措施，用于抗病育种和病害流行趋势预测中的病菌毒性监测。 DB51/T 11942011 1 稻瘟病菌生理小种鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了稻瘟病菌（ Magnaporthe oryzae）生理小种鉴定的术语、鉴别寄主选择、育苗、病菌采样、分离、培养、接种、保湿培养、调查记载方法及抗性评价等技术措施。 本标准适用于四川省稻瘟病菌生理小种鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改条款（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是
6、不注日期的引用文件，其最新版本均适用于本标准。 2.1 ISBN/S1676 农作物抗病虫性鉴定方法 2.2 ISBN/S1441 粮食作物种质资源抗病虫性鉴定方法 3 术语和定义 本标准采用下列术语定义： 3.1 对照品种 control variety 未检测出对病菌具有抗性基因，因而对病菌各个菌株均呈毒性反应的鉴别寄主，用以检测菌株活力或环境条件是否适宜、操作是否符合规范。 4 材料和用具 4.1 常用仪器及用具 常用仪器及用具包括: 剪刀； 1.6L 手持喷雾器； 超净工作台； 无菌载玻片； 试管； 接种针； 冰箱； DB51/T 11942011 2 带十字推进器的生物显微镜； 生化
7、培养箱 灭菌锅； 9mm 培养皿； 干燥灭菌箱； 低速离心机； 筛子 孔径 11cm ； 医用白磁盘 滤纸; 移液器; 保鲜袋; 带盖塑料箱 60 3045cm; 农用薄膜 白色和黑色两种； 变色硅胶； 400 目尼龙纱布; 稻田土; 农用复合肥 N ：P2O5:K2O=15:15:15 荧光灯 波长 470nm，40W 。 4.2 专用器具 4.2.1 密闭容器 带硅胶密封胶条保鲜盒。 4.2.2 样品架 将普通矿泉水瓶的瓶口剪下，断面磨平并沿直径方向在其边缘剪 2 个小凹槽。 4.2.3 挑针 从针尖剪取 4cm 医用银针连同橡皮将挑针固定在显微镜的玻片夹上。 4.3 设施 4.3.1 温
8、室 大棚温室，其内配 50cm 深水泥池，池上方设有自动喷雾装置。 4.3.2 玻璃温室 普通玻璃温室，无直射阳光，内外设喷雾降温设施、空调器调节温度至 261。 4.4 试剂及培养基 试剂及培养基包括： 75% 酒精； 1% 水琼脂； 0.02% 吐温 20 1 百菌清（2,4,5,6- 四氯-1,3- 二氰基苯）； 0.5% 双氧水； DB51/T 11942011 3 2 尿素； 酵母培养基（ 淀粉 10g、酵母粉 2g、琼脂粉 11g、水 1L）； 番茄燕麦培养基（燕麦片 40g，番茄汁 150ml，琼脂粉 20g，水 1L）。 4.5 鉴别寄主和对照品种 特特普、珍龙 13、四丰 4
9、3、合江 18、东农 363、关东 51、丽江新团黑谷等 7 个全国稻瘟病菌生理小种鉴别寄主，IR24、明恢 63、多恢 1 号、成恢 448 和內恢 99-14 等 5 个四川稻瘟病菌生理小种辅助鉴别寄主，丽江新团黑谷又为对照品种。当含新抗稻瘟基因型品种在四川推广面积超过 10,000hm2时，可以将其引入作为四川稻瘟病菌生理小种新辅助鉴别寄主。 5 鉴定方法 5.1 病菌样品采集 5.1.1 病圃设置 在稻瘟病常发区，选择在远离建筑物和道路、地形郁闭的田野设立病圃；病圃要求平坦、土壤肥沃、土质肥力均匀、地势低湿、排灌方便，利于稻瘟病发生。 5.1.2 标样采集和保存 在病圃播种、移栽当地主
10、栽品种和对照品种，生长期内不使用杀菌剂。穗颈瘟发病后采集各品种上的病穗颈，晾干后置于有干变色硅胶的密闭容器中于 4C 保存、备用。 5.2 病菌产孢 从不同病圃的丽江新团黑谷和当地主栽品种上各取同 70 个病穗颈，洗净后于无菌水中浸泡 3-4h，然后在 26下保湿培养 12h 即可产生大量分生孢子。 5.3 病菌分离 5.3.1 样品架固定 将样品架底部沾胶水，凹槽向上固定于超净工作台上的生物显微镜之聚光器上。 5.3.2 标样放置 把产孢病穗颈标样放在标样架的凹槽中，使标样与挑针垂直 5.3.3 标样和挑针位置调整 通过上下调整聚光器，使得标样边缘所产生的孢子在 10目镜清晰可见，通过调节显
11、微镜载物台使得挑针和孢子处于同一平面。 5.3.4 挑针消毒和湿润 移出挑针，用 75%酒精棉球将其烧红，用消毒后接种针挑取 1%水琼脂涂抹在挑针的尖端。 5.3.5 挑取孢子 DB51/T 11942011 4 将湿润的挑针尖端慢慢移动到视野中孢子较稀疏处，粘取单个孢子后将挑针移出视野，用消毒后接种针切割一小块淀粉酵母培养基，使其轻触挑针尖端以将孢子粘附在培养基块上。 5.3.6 病菌培养 将粘取孢子的培养基小块转入淀粉酵母培养基斜面。在试管上注明菌株编号、分离日期后，放入26、黑暗下培养。 5.4 接种体准备 5.4.1 菌丝培养 将单孢分离菌株在超净工作台中转入番茄燕麦培养基中，2 6、
12、全黑暗培养 57 天。 5.4.2 孢子培养 各培养皿分别用一无菌载玻片刮去菌落表面气生菌丝，置于荧光灯下（荧光灯与培养皿距离 38cm）、26下开盖培养过夜后闭盖培养 2-3 天。 5.4.3 孢子悬浮液制备 用 0.02%的吐温 20 洗下孢子，尼龙纱布过滤后于 3000r/min下离心 5min，弃上清液，加 0.02%的吐温 20 配制成浓度为 5105个/mL的孢子悬浮液备用。 5.5 离体叶片制备 5.5.1 秧苗培育 5.5.1.1 装土 过筛稻田土与 5kg/m3复合肥混匀后装入医用白瓷盘至 2/3 容积并压平压紧。 5.5.1.2 土壤消毒 每盘均匀浇灌 1百菌清溶液 500
13、mL。 5.5.1.3 种子消毒 各鉴别寄主种子以 0.5%双氧水浸种 24h 后，用清水再浸泡 24h。 5.5.1.4 催芽 消毒种子滤去水分后于 38催芽 12h。 5.5.1.5 播种 消毒种子播于白瓷盘消毒土中，每个瓷盘播 10 行，每行 12 粒，每个品种播 2 行。播后表面覆上0.5cm 厚的细土。播种后白磁盘置入薄膜覆盖的水泥池中。 5.5.1.6 苗期管理 出苗 1.5-2cm 后喷施 1的百菌清溶液，揭开膜两端通风。当外界温度大于 26时薄膜上方喷水降温。两叶一心期防治稻蓟马一次并追施 2尿素溶液 100mL/盘，接种前 3 天按照同样用量再追施一次尿DB51/T 1194
14、2011 5 素。整个育苗过程需保持盘内泥土湿润但不积水。当秧苗长至三叶一心期，心叶长度达 4-5cm 时，即可用于接种。 5.5.1.7 培养皿准备 将 2 张滤纸片放入塑料培养皿中，以无菌水湿润滤纸片后倒去多余水份。 5.5.1.8 离体叶片装皿 将三叶一心秧苗心叶剪下，去掉尖端后正面朝上，贴在培养皿中湿润滤纸上，离体叶片两端用滤纸条压住，每皿贴 5 片叶片，培养皿中写上品种名称和拟接种菌株的编号备用。 5.6 接种和保湿 5.6.1 接种 在叶表面及培养皿盖内侧喷 0.02%的吐温溶液直至布满明显细雾滴但雾滴不聚合，将配好的病菌孢子悬浮液摇匀，用移液器吸取后点于离体叶片上，每叶片点 4
15、滴，每滴 20l。每个菌株接种各品种 10张叶片。 5.6.2 黑暗保湿 接种后将培养皿放入底部有 0.5cm 水层的白瓷盘中，用保鲜袋将瓷盘包裹后置于四壁喷有 0.02%吐温 20 溶液、底部有 1cm 水层的塑料方盒中，盒口盖一层喷有 0.02%吐温 20 溶液的黑色农用薄膜后盖上盒盖，于 20-27的黑暗环境下保湿 24h。 5.6.3 潜育期管理 保湿培养完毕后将白瓷盘转入 26的玻璃温室中，玻璃温室每隔 30min 从上方喷雾 3min。 5.7 发病调查 5.7.1 调查方法 接种7天后调查，病斑分6级，按附录A中规定的分级标准进行调查记载。调查时记录接种总叶片数、各病级的病叶数。
16、 5.7.2 无效数据 当对照品种叶片发病率低于50%时，该菌株接种无效。 5.8 重复测定 接种有效但呈抗病反应的品种-菌株组合需重新剪取离体叶片接种，调查后仍呈抗病反应的组合，须再重复接种一次。经三次重复接种均呈抗病反应，才能判定该品种-菌株组合为非毒性反应。 6 生理小种命名： 6.1 毒性积分计算： 对丽江新团黑谷、IR24、明恢63、多恢1号、成恢448或內恢99-14具有毒性的毒性分数分别计为1、2、4、8、16、32，新引入辅助鉴别寄主毒性分数以此类推；毒性积分为侵染寄主所获毒性分数之和。 DB51/T 11942011 6 6.2 生理小种鉴定 全国稻瘟病菌生理小种鉴别寄主接种
17、结果以全国稻瘟病菌生理小种联合试验组（1980）方法进行小种鉴定。四川辅助鉴别寄主鉴定结果则根据各菌株对鉴别寄主有无毒性，参照附录B1中各地方生理小种对鉴别寄主的毒性谱和毒性积分，鉴定各菌株所属四川地方生理小种。 6.3 毒性类型鉴定 当菌株接种后毒性谱和毒性积分不同于附录B1中所列的各小种，则将该菌株鉴定为毒性类型，并以其毒性积分加以命名。 6.4 新小种鉴定 当新毒性类型在群体中频率显著高于0.5%，且能够引起属新抗稻瘟基因型的抗病品种发病，可鉴定为新的四川稻瘟病菌小种，其命名自CB22类推。 DB51/T 11942011 7 AA 附 录 A （资料性附录） 稻瘟病菌离体叶片接种发病病
18、情分级标准 A.1 瘟病菌离体叶片接种发病病情分级标准 发病级别 病斑 抗性评价 0级 叶面上无病斑 抗(R) 1级 叶面上出现针尖大小的褐色小点 抗(R) 2级 病斑褐色，直径约为0.51mm 抗(R) 3级 病斑直径小于2mm，梭形，中央灰白色而边缘褐色，无坏死线 感(S) 4级 病斑长约 34mm，有典型的“三部一线” ，梭形，扩展 感(S) 5级 有2个及2个以上四级病斑 感(S) DB51/T 11942011 8 BB 附 录 B （资料性附录） 稻瘟病菌生理小种对辅助鉴别寄主的毒性谱和毒性积分表 B.1 稻瘟病菌生理小种对辅助鉴别寄主的毒性谱和毒性积分表 小种 丽江新团黑谷 IR
19、-24 明恢63 多恢一号 成恢448 内恢99-14 毒性积分CB0 S R R R R R 1 CB1 S S R R R R 3 CB2 S R S R R R 5 CB3 S S S R R R 7 CB4 S R R S R R 9 CB5 S S R S R R 11 CB6 S R S S R R 13 CB7 S S S S R R 15 CB8 S R S R S R 21 CB9 S S S R S R 23 CB10 S R S S S R 29 CB11 S S S S S R 31 CB12 S S R R R S 35 CB13 S R S R R S 37 CB14 S S S R R S 39 CB15 S S R S R S 43 CB16 S R S S R S 45 CB17 S S S S R S 47 CB18 S R S R S S 53 CB19 S S S R S S 55 CB20 S R S S S S 61 CB21 S S S S S S 63
