1、 Numro de rfrence ISO 20666:2008(F) ISO 2008NORME INTERNATIONALE ISO 20666 Premire dition 2008-12-15Qualit de leau Dtermination de la toxicit chronique vis-vis de Brachionus calyciflorus en 48 h Water quality Determination of the chronic toxicity to Brachionus calyciflorus in 48 h ISO 20666:2008(F)
2、PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur employ cet effet ne bnficie dune licence autorisant lutilisati
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5、de ce fichier par les comits membres de lISO. Dans le cas peu probable o surviendrait un problme dutilisation, veuillez en informer le Secrtariat central ladresse donne ci-dessous. DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2008 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cett
6、e publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lISO ladresse ci-aprs ou du comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56
7、 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Publi en Suisse ii ISO 2008 Tous droits rservsISO 20666:2008(F) ISO 2008 Tous droits rservs iii Sommaire Page Avant-propos. iv Introduction v 1 Domaine dapplication 1 2 Rfrences normatives 1 3 Ter
8、mes et dfinitions 2 4 Principe 2 5 Environnement de lessai. 3 6 Ractifs, organismes pour essai et milieux. 3 7 Appareillage 4 8 Traitement et prparation des chantillons . 5 9 Mode opratoire 6 10 Expression des rsultats . 9 11 Critres de validit 10 12 Rapport dessai . 10 Annexe A (informative) Prpara
9、tion du milieu LC OLIGO 12 Annexe B (informative) Donnes relatives la fidlit. 14 Bibliographie 15 ISO 20666:2008(F) iv ISO 2008 Tous droits rservsAvant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO)
10、. Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participe
11、nt galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits tec
12、hniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur
13、 le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LISO 20666 a t labore par le comit technique
14、 ISO/TC 147, Qualit de leau, sous-comit SC 5, Mthodes biologiques. ISO 20666:2008(F) ISO 2008 Tous droits rservs v Introduction La mise en vidence deffets nfastes pour la qualit de leau passe, depuis plusieurs annes, par la ralisation dessais biologiques. Les rotifres, et en particulier lespce Brach
15、ionus calyciflorus, sont intressants du point de vue cotoxicologique car ils prsentent lavantage de se reproduire par parthnogense et de possder un trs court temps de gnration: une seule mre maintenue dans des conditions favorables pendant 48 h produit plusieurs pontes. Brachionus calyciflorus est u
16、n organisme du zooplancton qui vit dans les eaux douces. Ces animaux sont des consommateurs primaires et servent de proie un grand nombre dinvertbrs et de larves de poisson. Lessai spcifi dans la prsente Norme internationale se droule sur 48 h et porte donc sur au moins trois pontes dun seul organis
17、me mature (voir Rfrence 11). NORME INTERNATIONALE ISO 20666:2008(F) ISO 2008 Tous droits rservs 1 Qualit de leau Dtermination de la toxicit chronique vis- vis de Brachionus calyciflorus en 48 h AVERTISSEMENT Il convient que lutilisateur de la prsente Norme internationale connaisse bien les pratiques
18、 courantes de laboratoire. La prsente Norme internationale na pas pour but de traiter tous les problmes de scurit qui sont, le cas chant, lis son utilisation. Il incombe lutilisateur dtablir des pratiques appropries en matire dhygine et de scurit et de sassurer de la conformit la rglementation natio
19、nale en vigueur. IMPORTANT Il est absolument essentiel que les essais conduits conformment la prsente Norme internationale soient effectus par du personnel ayant reu une formation adquate. 1 Domaine dapplication La prsente Norme internationale spcifie une mthode de dtermination de la toxicit chroniq
20、ue vis-vis du rotifre Brachionus calyciflorus, base sur linhibition de la croissance de la population en 48 h. Cette mthode est applicable: a) aux substances chimiques solubles ou pouvant tre maintenues en suspension ou en dispersion stable dans les conditions de lessai; b) aux effluents industriels
21、 ou aux eaux uses, traits ou non, le cas chant aprs dcantation, filtration ou centrifugation; c) aux eaux douces; d) aux extraits aqueux. La prsente Norme internationale nest applicable ni aux essais de produits chimiques instables dans leau (hydrolysables, susceptibles dabsorber, etc.), sauf si lon
22、 mesure la concentration dexposition, ni aux essais effectus sur des chantillons aquatiques provenant dun milieu marin ou estuarien. 2 Rfrences normatives Les documents de rfrence suivants sont indispensables pour lapplication du prsent document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique
23、. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 5667-16:1998, Qualit de leau chantillonnage Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des chantillons ISO 5814, Qualit de leau Dosage de loxygne dissous Mthode
24、lectrochimique la sonde ISO 10523, Qualit de leau Dtermination du pH ISO 20666:2008(F) 2 ISO 2008 Tous droits rservs3 Termes et dfinitions Pour les besoins du prsent document, les termes et dfinitions suivants sappliquent. 3.1 lot tmoin srie de rpliques contenant la solution tmoin (3.2) ISO 20665:20
25、08 NOTE Dans la prsente Norme internationale, 8 rpliques constituent le lot tmoin. 3.2 solution tmoin mlange de milieu dessai et de nourriture sans lchantillon soumis essai ISO 20665:2008 3.3 concentration effective produisant x % dinhibition de croissance de la population CE xconcentration estime d
26、e lchantillon produisant une augmentation x % de linhibition de croissance de la population (3.4) par rapport au lot tmoin (3.1) 3.4 inhibition de croissance de la population comparaison du nombre total de femelles (jeunes et mres) la fin de lessai, entre le lot dessai (3.5) et le lot tmoin (3.1) 3.
27、5 lot dessai srie de rpliques contenant la mme solution dessai (3.6) ISO 20665:2008 NOTE Dans la prsente Norme internationale, 8 rpliques constituent un lot dessai. 3.6 solution dessai mlange constitu du milieu dessai, de nourriture et de lchantillon soumis essai ISO 20665:2008 4 Principe Des femell
28、es Brachionus calyciflorus, ges de moins de 2 h au dbut de lessai, sont exposes individuellement une gamme de concentrations de lchantillon soumis essai pendant une priode de 48 h. Lessai porte sur la croissance de la population de rotifres planctoniques par reproduction parthnogntique. la fin de le
29、ssai, le nombre de rotifres femelles est dtermin et, par comparaison avec le tmoin, les pourcentages dinhibition de croissance de la population sont dtermins pour chaque concentration. Les donnes obtenues permettent, en utilisant un modle de rgression, de calculer la concentration qui provoque x % d
30、inhibition de croissance de la population (CE x ), par exemple CE 10 , CE 20ou CE 50 . ISO 20666:2008(F) ISO 2008 Tous droits rservs 3 5 Environnement de lessai Raliser lessai labri de la lumire dans une enceinte ou un local thermostat de manire obtenir une temprature de (25 1) C dans les rcipients
31、pour essai. Maintenir latmosphre exempte de vapeurs ou poussires toxiques. Cela est vrifi par la production de solutions tmoins. 6 Ractifs, organismes pour essai et milieux Utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue, sauf spcification contraire. 6.1 Organismes pour essai Les femel
32、les de lespce Brachionus calyciflorus (Monogonota, Rotifera) sont obtenues partir dun levage de laboratoire (voir Rfrences 3, 12, 13) ou provenant de sporocystes disponibles sur le march 1) . Il convient de procder une vrification de la sensibilit des organismes laide de sulfate de cuivre pentahydra
33、t ou de pentachlorophnolate de sodium (NaPCP) (voir 6.5). Dans le cas o lon utilise des sporocystes, employer la premire gnration de Brachionus calyciflorus, obtenue en faisant clore des sporocystes dans les conditions suivantes. Transfrer les sporocystes dans un rcipient contenant le milieu dessai
34、(6.3), par exemple 15 mg de sporocystes dans environ 10 ml de milieu dessai. Incuber le rcipient (25 1) C pendant une dure de 18 h 24 h, dans des conditions dclairage continu dintensit comprise entre 1 000 lx et 4 000 lx (7.7). Un apport de nourriture nest pas ncessaire lclosion des sporocystes. Cep
35、endant, il est possible daugmenter le taux de multiplication des rotifres en ajoutant des algues, juste aprs lclosion des premiers nouveau-ns, en quantit identique celle indique en 6.4. Comme alternative, il est possible dajouter 100 g/l de nourriture inerte ROTIRICH 1)comme supplment alimentaire po
36、ur levage (Rfrence 18). Dans la mesure o les animaux utiliss pour lessai doivent tre gs de moins de 2 h, il convient de surveiller lclosion partir de 17 h dincubation, puis toutes les demi-heures. Lessai est dmarr lorsque le nombre de jeunes rotifres est jug suffisant pour effectuer un essai complet
37、. EXEMPLE Pour un essai avec cinq concentrations et un tmoin (soit 48 rotifres), cette condition est gnralement remplie environ 1 h aprs que la premire closion a t observe. Le temps de reproduction est relativement stable au sein dun mme laboratoire, ce qui permet une planification de la reproductio
38、n de faon disposer dun nombre suffisant de jeunes durant les heures de travail. 6.2 Eau pure, de conductivit infrieure 10 S/cm 2) . 6.3 Milieu dessai, prpar par dissolution des substances minrales suivantes dans 1 l deau pure (6.2): NaHCO 396 mg CaSO 4 , 2H 2 O 60 mg MgSO 460 mg KCl 4 mg 1) Des spor
39、ocystes rotifres dshydrats et du ROTIRICH sont des exemples de produits appropris disponibles sur le march. Cette information est donne lintention des utilisateurs de la prsente Norme internationale et ne signifie nullement que lISO approuve ou recommande lemploi exclusif des produits ainsi dsigns.
40、2) 1 mS/m. ISO 20666:2008(F) 4 ISO 2008 Tous droits rservsCe milieu dessai correspond une eau synthtique moyennement dure, cest-dire 80 mg CaCO 3par litre 100 mg CaCO 3par litre (voir Rfrence 14). Ainsi prpar, le milieu a un pH de 7,6 0,3. Conserver cette solution labri de la lumire temprature ambia
41、nte et lutiliser dans les 7 jours suivant sa prparation. Arer le milieu dessai jusqu ce que sa concentration en oxygne dissous ait atteint la valeur de saturation dans lair et jusqu stabilisation du pH. Si ncessaire, ajuster le pH 7,6 0,3 laide dune solution dhydroxyde de sodium ou dacide chlorhydri
42、que. La concentration de la base ou de lacide requis doit tre choisie de manire que le volume ajouter soit aussi faible que possible. Amener la temprature du milieu dessai (25 1) C avant utilisation. 6.4 Nourriture, compose dalgues Chlorella vulgaris. Les algues sont cultives dans tout milieu approp
43、ri (par exemple LC OLIGO, voir Annexe A). Elles sont utilises lorsque la culture est en phase exponentielle de croissance. La concentration algale lors de lessai doit tre comprise entre 2 10 6et 3 10 6cellules par millilitre. Pour cela, ajuster pralablement la concentration en centrifugeant la cultu
44、re (par exemple durant 20 min 20 000 ms 2 ) et remettre en suspension les algues en agitant avec un volume suffisant de milieu dessai (6.3) pour obtenir une suspension denviron 2 10 7cellules par millilitre 3 10 7cellules par millilitre. Cette concentration permet dapporter de 2 10 6cellules 3 10 6
45、cellules en utilisant un volume de 0,1 ml. La culture dalgues peut tre conserve (4 3) C labri de la lumire, pendant une dure maximale de 10 jours. La nourriture peut aussi tre compose dalgues Pseudokirchneriella subcapitata 3)(anciennement dnom- mes Selenastrum capricornutum ou Raphidocelis subcapit
46、ata). La concentration algale lors de lessai doit tre comprise entre 1 10 6cellules par millilitre et 1,5 10 6cellules par millilitre. Lutilisation dalgues immobilises dans une matrice inerte (glose), sous forme de billes dalgues 4)est possible. Dans ce cas, aprs dissolution de la matrice, centrifug
47、er les algues, liminer le surnageant et remettre les algues en suspension en les agitant dans le milieu dessai (6.3). Recommencer cette opration une seconde fois. La concentration algale dans le milieu dessai doit se situer dans la fourchette spcifie ci- dessus. 6.5 Substance de rfrence Le NaPCP (C 6 Cl 5 ONa) et/ou le sulfate de cuivre pentahydrat (CuSO 4 , 5H 2 O) peuvent tre utiliss. ATTENTION En cas dutilisation du pentac
