1、 Numro de rfrence ISO 21427-2:2006(F) ISO 2006NORME INTERNATIONALE ISO 21427-2 Premire dition 2006-11-15Qualit de leau valuation de la gnotoxicit par le mesurage de linduction de micronoyaux Partie 2: Mthode de la population mlange laide de la ligne de cellules V79 Water quality Evaluation of genoto
2、xicity by measurement of the induction of micronuclei Part 2: Mixed population method using the cell line V79 ISO 21427-2:2006(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut tre im
3、prim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur employ cet effet ne bnficie dune licence autorisant lutilisation de ces polices et que celles-ci y soient installes. Lors du tlchargement de ce fichier, les parties concernes acceptent de fait la responsabilit de ne pas enfreindre l
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6、i-dessous. DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2006 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, san
7、s laccord crit de lISO ladresse ci-aprs ou du comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Version franaise parue en 2009 Publi en Suisse ii ISO 2006 Tous dr
8、oits rservsISO 21427-2:2006(F) ISO 2006 Tous droits rservs iiiSommaire Page Avant-propos .iv 1 Domaine dapplication 1 2 Rfrences normatives .1 3 Termes et dfinitions 1 4 Principe.3 5 Interfrences 3 6 Ractifs et milieux .3 7 Appareillage .7 8 Critres relatifs linstallation dessai 8 9 Mode opratoire.8
9、 10 valuation et estimation .12 11 Fidlit 14 12 Rapport dessai14 Annexe A (informative) Mthode la bromodsoxyuridine (BrdU) .16 Annexe B (informative) Schmas dvaluation 18 Annexe C (normative) Fraction S9 19 Annexe D (informative) Donnes de fidlit.20 Bibliographie.21 ISO 21427-2:2006(F) iv ISO 2006 T
10、ous droits rservsAvant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une t
11、ude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la
12、normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soum
13、is aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogu
14、es. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LISO 21427-2 a t labore par le comit technique ISO/TC 147, Qualit de leau, sous-comit SC 5, Mthodes biologiques. LISO 21427 comprend les parties suivantes, prsentes sous le
15、titre gnral Qualit de leau valuation de la gnotoxicit par le mesurage de linduction de micronoyaux: Partie 1: valuation de la gnotoxicit laide de larves damphibiens Partie 2: Mthode de la population mlange laide de la ligne de cellules V79 NORME INTERNATIONALE ISO 21427-2:2006(F) ISO 2006 Tous droit
16、s rservs 1Qualit de leau valuation de la gnotoxicit par le mesurage de linduction de micronoyaux Partie 2: Mthode de la population mlange laide de la ligne de cellules V79 AVERTISSEMENT Il convient que lutilisateur de la prsente partie de lISO 21427 connaisse bien les pratiques courantes de laborato
17、ire. La prsente norme na pas pour objectif de traiter tous les problmes de scurit qui sont, le cas chant, lis son utilisation. Lutilisateur est tenu dtablir des pratiques de scurit et dhygine appropries et de sassurer de leur conformit aux rglementations nationales existantes. IMPORTANT Il est absol
18、ument essentiel que les essais mens conformment la prsente partie de lISO 21427 soient raliss par un personnel ayant reu une formation adquate. 1 Domaine dapplication La prsente partie de lISO 21427 spcifie une mthode permettant de dterminer la gnotoxicit de leau et des eaux uses par un essai ralis
19、in vitro sur des mammifres pour dtecter les dommages induits par les substances hydrosolubles sur les chromosomes ou lappareil mitotique des cellules V79 du hamster chinois. Lessai du micronoyau permet didentifier les substances provoquant des dommages cytogntiques lorigine de la formation de micron
20、oyaux contenant des fragments de chromosome retardataires et/ou des chromosomes entiers retardataires. Lanalyse est base sur laugmentation de la frquence des cellules micronucles aprs une incubation avec et sans activation mtabolique. 2 Rfrences normatives Les documents de rfrence suivants sont indi
21、spensables pour lapplication du prsent document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 5667-16, Qualit de leau chantillonnage Partie 16: Lignes directrices pour
22、les essais biologiques des chantillons 3 Termes et dfinitions Pour les besoins du prsent document, les termes et dfinitions suivants sappliquent. 3.1 lignes cellulaires familles distinctes de cellules cultives provenant dun seul clone ISO 21427-2:2006(F) 2 ISO 2006 Tous droits rservs3.2 solution de
23、cofacteurs solution aqueuse de produits chimiques (par exemple NADP, glucose-6-phosphate et sels inorganiques) ncessaires lactivit des enzymes de la fraction S9 3.3 degr de dilution D dnominateur du coefficient de dilution (en utilisant le numrateur 1) dun mlange deau ou deaux uses et deau de diluti
24、on, sous forme dun nombre entier NOTE Lorsque leau ou les eaux uses ne sont pas dilues, ce coefficient est par dfinition 1:1. La plus faible valeur D correspondante possible est 1. 3.4 valeur D plus faible valeur de D laquelle, dans les conditions dfinies dans la prsente partie de lISO 21427, aucune
25、 augmentation du nombre de micronoyaux par culture nest observe NOTE En prsence de plus dune valeur D (deux sont possibles au maximum, voir 9.2), la valeur D la plus leve est dterminante. 3.5 caryotype caractristique du noyau dune cellule, dfinie par la taille, la forme et le nombre de chromosomes 3
26、.6 micronoyaux petites particules formes de fragments acentriques de chromosomes et/ou de chromosomes entiers, qui ne migrent pas au cours de lanaphase de la division cellulaire et qui, aprs la tlophase, forment un ou plusieurs micronoyaux dans le cytoplasme 3.7 index mitotique pourcentage de cellul
27、es en division dans une population de cellules un moment dobservation particulier 3.8 efficacit densemencement mesure du nombre de colonies issues de cellules uniques 3.9 index de prolifration vitesse laquelle les cellules se divisent dans la culture 3.10 vitesse de prolifration vitesse laquelle les
28、 cellules se rpliquent, calcule par une formule tenant compte des stades 1, 2, 4 et 8 cellules des clones 3.11 fraction S9 9 000 g de surnageant dun homognat tissulaire dans 0,15 mol/l de KCl, obtenu partir de foies de rats mles (200 g 300 g) prtraits par une substance ou une combinaison de substanc
29、es approprie pour linduction enzymatique 3.12 mlange S9 mlange de la fraction S9 et de la solution de cofacteurs ISO 21427-2:2006(F) ISO 2006 Tous droits rservs 33.13 culture souche culture congele afin de conserver les caractristiques des cellules V79 3.14 index de survie pourcentage de cellules su
30、rvivantes par rapport au nombre total de cellules, utilis comme indice de toxicit 3.15 culture dessai culture cellulaire utilise pour ltude 4 Principe Lventuelle activit clastogne et/ou aneugne de lchantillon pour essai est dtecte en comparant, pour la condition dactivation respective, le nombre de
31、cellules micronucles dans des cultures traites par le tmoin ngatif et leur nombre dans des cultures traites respectivement par des chantillons pour essai non dilus et dilus. Au cours de la division cellulaire, les fragments de chromatides dpourvus de centromre ne se dplaceront pas vers les noyaux de
32、s cellules filles et resteront dans le cytoplasme. Certaines aberrations chromosomiques induites par llment dessai consistent en des fragments de chromatides dpourvus de centromre qui ne seront donc pas incorpors dans les noyaux des cellules filles. De plus, des anomalies du fuseau peuvent gnrer des
33、 chromosomes qui ne sont pas incorpors dans le noyau. Ces particules formeront des micronoyaux dans le plasma. Les cellules V79 sont exposes pendant 24 h (4 h avec le mlange S9) une gamme de concentrations dun chantillon pour essai. Des lames sont ensuite prpares, les cellules sont colores et la prs
34、ence de cellules micronucles est value. Une incidence accrue de ces cellules micronucles par rapport au tmoin ngatif indique que llment dessai peut provoquer une fragmentation des chromosomes ou des anomalies du fuseau dans les cellules V79 in vitro. 5 Interfrences Des modifications biologiquement p
35、ertinentes des conditions de culture peuvent induire une aberration chromosomique due des mcanismes secondaires donnant un positif artificiel et donc des rsultats non pertinents 16 . Ces facteurs sont, par exemple, des variations plus importantes de losmolalit ou du pH, la prcipitation de lchantillo
36、n pour essai et sa phagocytose, et des effets cytotoxiques importants de lchantillon pour essai. Par consquent, il convient de surveiller les chantillons pour essai, au moins en ce qui concerne les variations du pH ou de losmolalit des cultures, en utilisant la mme proportion dlment dessai par cultu
37、re que celle qui sera utilise ultrieurement dans les conditions dessai. En cas de variation du pH de la culture, il convient de rgler le pH de llment dessai 7,0 0,2. En cas de variation de losmolalit, la plus forte concentration utilise lors de lessai doit tre rduite afin dviter toute variation corr
38、espondante de losmolalit dans les cultures. Pour viter les artfacts dus la phagocytose ou une cytotoxicit svre, il convient de respecter les limites indiques pour la concentration la plus leve lors des essais (voir 9.1 et 9.2). 6 Ractifs et milieux Dans la mesure du possible, utiliser des produits c
39、himiques de qualit ractif. Si des produits chimiques ayant diffrentes teneurs en eau de cristallisation sont utiliss, calculer les quantits requises en consquence. Toujours effectuer le passage lautoclave pendant 20 min 121 C 2 C. Recouvrir les rcipients sans serrage (par exemple laide dune feuille
40、daluminium). Ne jamais les fermer de manire tanche. ISO 21427-2:2006(F) 4 ISO 2006 Tous droits rservs6.1 Eau. Prparer toutes les solutions aqueuses avec de leau ayant une conductivit infrieure ou gale 5 S/cm. 6.2 Ractifs. 6.2.1 Glucose-6-phosphate dihydrat, C 6 H 11 O 9 PNa 2 , 2H 2 O. 6.2.2 Nicotin
41、amide-adnine-dinuclotide phosphate, sel disodique, NADP, C 21 H 26 N 7 Na 2 O 17 P 3 . 6.2.3 Chlorure de magnsium hexahydrat, MgCl 2 , 6H 2 O. 6.2.4 Dihydrognophosphate de potassium, KH 2 PO 4 . 6.2.5 Hydrognophosphate disodique dihydrat, Na 2 HPO 4 , 2H 2 O. 6.2.6 thanol (absolu), C 2 H 5 OH. 6.2.7
42、 Acide actique glacial, CH 3 COOH. 6.2.8 Formaldhyde, HCHO, 37 % en fraction volumique. 6.2.9 Citrate trisodique dihydrat, HOC(COONa)(CH 2 COONa) 2 , 2H 2 O. 6.2.10 Hydrognophosphate disodique, Na 2 HPO 4 . 6.2.11 Dihydrognophosphate de sodium, NaH 2 PO 4 . 6.2.12 Solution de May-Grnwald, modifie 1)
43、 . 6.2.13 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l. 6.2.14 Solution dhydroxyde de sodium, c(NaOH) = 1 mol/l. 6.2.15 Dimthylsulfoxyde (DMSO), C 2 H 6 SO. 6.2.16 Tmoins positifs. 6.2.16.1 Cyclophosphamide, monohydrat, C 7 H 15 Cl 2 N 2 O 2 P, H 2 O. Numro CAS: 6055-19-2. 6.2.16.2 Sulfonate dthylmthane (E
44、MS), CH 3 SO 3 CH 2 CH 3 . Numro CAS: 62-50-0. 6.2.17 Solution de citrate de sodium pour traitement hypotonique. Prparer une solution aqueuse 1,5 % de citrate trisodique. 6.2.18 Solution de fixation. Mlanger 50 ml dacide actique glacial avec 150 ml dthanol, ajouter 2,5 ml dune solution de formaldhyd
45、e 37 %. 1) Ce ractif est disponible dans le commerce. Cette information est donne par souci de commodit lintention des utilisateurs de la prsente partie de lISO 21427 et ne signifie nullement que lISO approuve ou recommande lemploi exclusif du produit ainsi dsign. ISO 21427-2:2006(F) ISO 2006 Tous d
46、roits rservs 56.2.19 Solution tampon selon WEISE (pH 7,2) 1) . Cette solution est commercialise en ampoules. Diluer le contenu dune ampoule dans de leau et, laide dune fiole jauge de 1 000 ml, complter avec de leau. 6.2.20 Solution de Giemsa 1) . Prparer une solution de Giemsa 2,6 % dans la solution
47、 tampon selon WEISE (pH 7,2) (6.2.19). Filtrer avant utilisation. 6.2.21 Tampon phosphate. Dissoudre 2,13 g de Na 2 HPO 4dans 1 l deau. Dissoudre 1,8 g de NaH 2 PO 4dans 1 l deau. Mlanger ces deux solutions dans un rapport de 4:1 et ajuster le pH final 7,4. 6.2.22 Milieu MEM (= Milieu Essentiel Minimum) avec glutamine stabilise 1) . 6.2.23 Srum ftal de veau (= FCS) 1) . 6.2.24 Solution de pnicilline/streptomycine, 10 000 E/10 000 g/ml 1) . 6.2.25 Solution damphotricine B, 250 g/ml 1) . 6.2.26 S
