1、现代分子生物学 1.全自动测序仪 :原理 :在 DNA 片段中加入 4 种被巧光分别标记的 ddNTP 做为引慨 ddNTP 的作用是链终止剂，当进行 PCR 时，遇到 ddNTP 便会停止，因此会形成链长度不一的一系列片段，由于每个片段末端标记的巧光不同用激光探头扫描电泳后形成的按大小顺序跑出的条带，即可读出核巧酸序列。在片段中需加入 4 种不同的 ddNTP加入 PC 民需要的模板， Tap 聚合酶，缓冲液，及 dNTP， 进行单向 PCR， 产生长度不同的一系列片段。将 PCR 扩增出的片段进行 PAGE 电泳，其电泳后只跑出一个带用激光探头 扫描条带，即可读出相应序列。 2. (blu
2、e-white screening)蓝白斑筛选：是一种可 W在同一转化板上完成重组质粒的筛选方法。次方法涉及基因的插入失活，利用一种蓝色化合物的形成作为指示剂，在这种情况下失活的基因是lacZ， 该基因编码日 -半乳糖甘酶，受到启动子的调控，当大肠杆菌菌株表达 lac 阻抑物，则载体那个的 lacZ 基因由 IPTG 诱导表达，表达形成的酶可 W 利用底物 X-gal 形成蓝色化合物，重组质粒中lacZ 的插入失活导致不能形成蓝色菌落而形成白色菌落。 3. 五种重要的工具酶： 碱 性磷酸酶 ：从 DNA 或 RNA 的 5端去除磯酸基。 DNA 连接酶： 5-磯酸与 3-径基相结合。 DNA
3、聚合酶 1:沿 5至 3的方向合成与 DNA 模板互补的 DNA。 多核巧酸激酶：一个依赖 ATP 的反应，向双链或单链 DNAiRNA 的 5-哲基末端添加磯酸基。 末端转移酶：可将核巧酸加到单链或双链 DNA,RNA 的 3端。 质粒小量质备：仅从几毫升培养液中提取小量质粒用作分析的过程。 过程： 1 将携带有目的质粒的大麻杆菌接种于数毫升的液体培养基中进行培养。 2 增至 稳定期后，离也液形成菌体沉淀 3 用碱裂法提取 DNA (重悬碱裂体一中和 ） 4 酪抽提除去蛋白污染物 5 乙醇沉淀，对 DNA 及 RNA 进行浓缩 （ 可加入 RNaseA 降解 RNA) 6 在适宜的缓冲液中进
4、行悬浮。 不连续复制：在 DNA 复制中，两条新生链的合成在同一复制叉中同时进行，因 DNA 复制时只能 W5*-3方向进行，所 W 两条链中的一条链（即前导链）从起始点按 5,-3方向进行连续复制，而另一条链 (即随后链 )从复制叉处起始按 5*-3,方向反向形成冈崎片段，随着复制叉的前进，前导链被复制成连续长链，而滞后链形成不连续的网崎片段，之后被 DNA 连接酶连成连续的 DNA， 因此称为半不连续复制。 克隆技术的应用有：重组蛋白的生产，遗传修饰生物体的构建， DNA 指纹分析，医学诊断及基因治疗等。 DNasel 足迹法可确定与蛋白质作用的 DNA 实际序列区域。将末端标记的 DM
5、片段与蛋白质样品相混合，待相互泥合后用 DNasel 对复合物进行温度配对。在蛋白结合区域，核酸酶不能轻易接近DNA 骨架而难 W 切割，再将酶解的 DNA 进行 PAGE 电泳分析，在对照 DNA 的 泳道中的说状显示出所有随机的酶切割部位而在加入蛋白样品的泳道显示出某些带的空缺或未切割的区域，即对应于蛋白结合的 DM 位点（足迹 ） (嵌套 式） PCR:在第二次 PCR 中， W 第一次 PCR 的底物作为模板，使用一套新的引物，形成更短的 PCR 产物。可 W 避免非特异性产物的产生，排除其它基因成员，保证得到较纯的目的产物。 Southern 印迹：用来检测琼脂糖凝胶上众多 DNA
6、分子中能与特定探针杂交的 DNA 分子。 DNA片段经琼脂糖凝胶电泳后，通过毛吸作用转移至尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用碱变性使 DM 分子转变成单链 DNA， 然后干燥 使 DNA 固定在膜上，膜上 DM 的位置与凝胶中的完全相同，固定后用巧光标记的探针与其进行杂交，充分洗洛后，用放射自盛影法检测杂交的探针，从 而检测出 DNA 分子 4. 滚环的复制过程和特征：过程：在 DNA 复制过捏中， W 某种方式切断双链 DNA 中的一条链。其 5端与特珠的蛋白质相连， 3端由 DNA 聚合酶催化延伸。 W 未切断的一跳 球形链为模板加上新的核巧酸，由于 3端不断延长，而 5端不断被甩出成为游离的单位
7、，好像中间的环不断滚动一样，当游离的链达到一定程度时开始复制其互补链。特征：链的延伸不需要引物。模板是环状 的单向复制 I 形成多拷贝的串联复合物，由酶 从中切开，重新成环。 5. 双抗筛选：载体含有氨节青霉素抗性基因和四环素抗性基因，目的基因插入四环素抗性基因使其失活，将重组后的细菌在涂有氨节青霉素的平板上培养，然后再用影印平板法 将其印在含四环素的平板上，能在喊四环素的平板上生长的就是空载体，在含氨节青霉素的平板上找到在含四环素平板上没有的对应位子的菌落，这些菌落就含有重组载体。 6. 终止子的两个机制：不依赖 P 因于的转录终止和依赖于 P 因子的转录终止。不依赖的特点：具有自身互补配对
8、的序列，富含 GC， 能形成茎环或发夹结构 ，这种结构能使 RNA 聚合酶停在该位子，接着停止转录。有一长串的 U 结构，能造成 RNA 链与模板链的 结合不稳定，使 RNA 与 DNA分离终止转录。依赖的特点：有时也含有自身配对的序列。需要 P 蛋白的参与， P 因子能结合在新生的 RNA 的特定区域上利用水解 ATP 的 能量在 RNA 上移动，移动到转录复合物，脱离 RNA 酶，终止转录。 CRP-cAMP 复合物， Plac 并非强的启动子，为了实现高水平的转录要 CAP 受体，当葡萄搪高时细胞内 CAMP 水平会降低，当缺乏葡萄糖巧， cAMP 含量升高， cAMP 与 CAP 结合
9、成 CAP-cAMP复合物，结合在 RNA 聚合酶位点上游的乳搪操纵子 Plac 上， 引 起 DNA 键发生 90 度弯化增强 RNA 与启动自的结合，转录效率提高 50 倍。 excission repairing:切除修复，此系统是在几种酶的协同作用下，先在损伤的任一端打开稱酸二醋键，然后外切掉一段寡核巧酸；留下的缺口由修复性合成来 填补，再有连接酶将其连接起来。 mismatch repair:错配修复，在含有错配碱基的 DNA 分子中，使正常核巧酸序列恢复的修复方式。修复的过程是：识别出正确的链，切除掉不正确的部分，然 后通过 DNA 聚合酶和 DNA 连接酶的作用，合成正确配对的双
10、链 DNA。 (Southern blotting) Southern 印迹：用来检测琼脂搪凝胶上众多 DNA 分子中能与特定探针杂交的DNA 分子。 DNA 片段经琼脂糖凝胶电泳后，通过毛吸作用转移至尼龙膜或硝酸纤维膜 上，再用碱变性使 DNA 分子转变成单链 DNA， 然后干燥使 DNA 固定在膜上，膜上 DM 的位置 与凝胶中的完全相同，固定后用巧光标记的探针与其进行杂交，充分洗络后，用放射自显影 法检测杂交的探针，从而检测出 DNA 分子。 (DNAMelting) DNA 溶解： DNA 分子由于高温而引起 H 键的断裂，即热变性。 串联基因簇：基因组中串联重复数百次的某些基因或基因
11、簇区域构成中重复 DNA区段，如 rRNA基因和组蛋白基因簇。 C 值惇论： C 值是指生物体的单倍体基因组所含的 RNA 总量。原核生物的基因組比高等生物小，但高等生物中 C 值与生物复杂捏度无特定关系，如两栖动物的基因组比哺现动物还大，从总体上说，生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位无关，这一现象称为 C 值惇论。 可变剪接：从一个特定的基因转录物通过利用不同的 5 3,间接位点产生不同的成熟 mRNA， 四种方式 1 利用不同的启动子利用不同的 poly (a)位点保留某些内含子保留或去除某些外旱子 (DNA Annealing) DNA 退火： DNA 由复性变成双链的过程，同源
12、DNA 之间， DNA 和 RNA 之间退火则形成杂交分子。 7. (trans-acting factor)反式作用因子：参与基因表达调控的因子，它们与特异 的铅基因的顺式元件结合起作用，有两个重要的功能结构域 :DNA 结合结构域和转 录巧化结构域，它们是其发挥转录调控功能的必需结构。 8. (cis-acting element)顺式作用元件 ： 存在于基因旁侧序列中能影响基因表达 的序列 ， 它们的作用是参与基因表达的调控 ， 本身不编码任何蛋白质 ， 仅仅提供 一个作用位点 ， 要与反式作用因子相互作用而起作用。 9. (Transformation)转化：感受态细胞吸收外源 DNA
13、 的过程称作转化。是指将质粒或 其他外源 DNA 导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新表型的过程，转化常用的宿主 菌是大肠杆茵。 10. ( hnRNA)核内不均一 RNA;由 RNAPOLII 转录的所有 RNA 叫 hnRNA 期中可被加工 为成熟mRNA 的 RNA 成为前体 RNA。 11. (RNAi) RNA 干涉：由双链 RNA (dsRNA)介 导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象 ,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。 12. (DNA 化 naturation) DNA 变性：加热或用过量酸碱处理双链 DNA,使氨键断裂，结果 DNA变成为单链巧 .（ e
14、nhancer)增强子：指增加同它连锁的基因转录频率的 DNA 序列。増强子是 通过启动子来増加转录的。增强子的效应很明显，一般能使基因转录频率増加 10 200 倍，有的甚至可 W高达上千倍。 化 ase-excisionrepair， BER)碱基切除修复： DNA 分子中一旦产生了 AP 位点， AP 核酸内切酶就会 把受损核巧酸的糖巧 -磷 酸键切开，并移去包括 AP 位点核巧 酸在内的小片段 DNA， 由 DNA 聚合酶 I 合成合成新的片断，最终由 DNA 连接酶 把两者连成新的被修复的 DNA 链。 (Genomic Library)基因组文库：巧限制性内切酶切割细胞的整个基因组
15、 DNA， 可得到大量的基因组 DNA 片段，然后将这些 DNA 片段与载体连接，再转化到 细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的毎个细胞的载体上都包含有 特定的基因组 DNA 片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。 (multiple cloning site, MCS)多克隆位点 ： 指多个限制性内切酶的单一切点 ， 由许多限制性内切酶位点组成 ， 往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的 DNA 序列。 (RFLP)限制性内切酶片段长度多态性： DNA 某一位点上的变异有可能引起该 位点特异性的限制性内切酶识别位点的改变，它包括原有位点的消失或出现新的 酶切位点，致使
16、酶切片段的长度随之发生变化。 (Reporter genes)报告基因 ： 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因 ， 是一种 表达产物非常容易被鉴定的基因。 13. (Splicing)剪接：内含子在 mRNA 成熟和翻译之前被切除的过程称为剪接，外现在在 剪接时重新拼接起来，形成成熟的 mRNA, 般来说剪接包括从初始转录产物精确的去 掉内含子，然后切点两侧的 mRNA 末端重新连接，外显子形成新的完整的分子。 14. (SS 巧单链结合蛋白：结合于螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生的单链区，防止新形成的单链 DNA 重新配对形成双链 DNA 或被核酸酶降解的蛋白质。作用：保证被解链酶解开的单链
17、在复制完成前能保持单链结构，它 W 四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环。所 W，SSB 蛋白只保持单链的存在，并不能起解链的作用。可 W 保护单链 DNA 不被酶水解。它与酶不同，不具催 化巧性，但能改变复制过程中的平衡状态和反应速度。 15. (knock-out)基因敲除：是建立在基因同源重组技术基础 W 及胚胎干细胞技术基 础上的一种新分子生物学技术。通过同源重组将外源基因定点整合入祀细胞基因組 上某一确定的位点， W达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。步骤： ES 细 胞的获得 基固茎 化的构 建将基因载体通过一定的方式导入同源的化胎干细胞中用选择性培养基筛选已
18、击中的细胞观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进 而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变。 16. 概括典型原核和真核生物启动子的结构和功能，并解释什么是保守序列？ 启动子是与 RP 结合和转录起始的特殊序列。原核生物的结构： -35 区，位于复制起点上游35 个核巧酸处的 6 个核巧酸序列 TTGACA， 能够被 RNA 聚合酶全酶识别并结合。 -10 区 I 位 tlO 处的 6 个核巧酸序列 TATAAT， 是 RP 能够识别 DNA 双链中的 反义链，确保转录的链和方向无误。 17. 转录终止的两种机制？原核生物中翻译如何让调节转录终止？ 一 ，两种机制是在某一位点不需要其他因子协
19、助，仅依赖于内在终止子的终止机制 依赖于 P 因子的终止机制。 二，翻译可迅过弱化作用调节转录终止。例如 :发生在氨基酸的生物合成基因的表达中， 前导肤的翻译可调节结构基因下游的转录，这种调节重要性充分体现在氨基酸的生物 合成中，原核生物细胞中转录和翻译是同时发生的，正在翻译的核糖体就像在追赶正在 转录的 RNA 聚合酶，具有所需氨基酸 tRNA 时，核糖体将前导序列翻译成前导肤，而 在终止密码子处停止翻译，新生的 mRNA自由形成 3-4 发夹结构，所 W 阻碍了 DNA 指 导 RNA 聚合 酶的前进，结构基因的转录终止，即发生弱化现象。 18. 郛糖操纵子的调控方式：糖巧酶、透酶、艺酌基
20、转移酶，此外还有一个操纵序列 0、一 个启动序列 P 及一个调节基因 I。阻遏蛋白的负性调节：在没有乳糖存在时，乳塘操 纵子处于阻遏状态。此时， I 基因列在 P 启动序列操纵下表达的乳搪阻遏蛋白与 0 序列 结合，故阻断转录启动。当有乳糖存在时，乳糖操级子即可被诱导。真正的诱导剂并非 乳糖本身。乳糖经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数 e -半乳搪 巧酶催化，转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，引起阻抑物四聚 体 构象变化，降低其亲和力，使其从操纵子上掉落下来，开始 lacZYA 基因的转录。 CAP 的正性调节：分解代谢物基因激活蛋白 CAP 是同二聚体，在其
21、分子内有 DNA 结合区 及 cAMP 结合位点。当没有葡萄糖及 cAMP 浓度较高时， cAMP 与 CAP 结合，这时CAP 结合在乳搪启动序列附近的 CAP 位点，可刺激 RNA 转录活性，使之提髙 50 倍；当葡 萄搪存在时， cAMP 浓度降低， cAMP 与 CAP 结合受阻，因此郭糖操纵子表达下降。 19. 色氨酸操纵子 (tryptophane operon)负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸 时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操级子被打开， trp 基因表达，色氨酸或与其 代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用 减色效应：碱基在疏水环境中堆积，使
22、碱基对的紫外光吸收减小的现象。如单一的核巧酸在 A260的光吸收值最大，其次单链 DNA或 RNA,双链 DNA 最小 増色效应：由于 DNA 变性引起的光吸收增加称増色效应，也就是变性后 DNA 溶液的 紫外吸收作用增强的效应。 20. 在 DNA 复制中，连续合成的子链成为前导链，另一条非连续合成的子链成为滞后链。 21. 就克一个基因来说最简单的质粒载体也必须包巧 S 个部分，复制区 （ 合成复制起点 )，选择标记（主要是抗性基因），克隆位点（便于外源 DNA 插入）。 22. 为了防止载体自身环化，可 W 用碱性憐酸酶脱去载体的 5.端 磷 酸基团。 23. 产生单个碱基变化的突变叫点
23、突变如果碱基的变异不改变编码氨基酸，送就是同义突变，如果改变，就叫错义突变。 24. 真核生物 mRNA 加工过程中， 5 端加上帽子结构， 3 端加上 poly(A)尾己，如果被转录基因是不连续的，那么内含子一定要被除去，并迅过剪接过程将外显子连接在一起。 26.大肠杆菌 DNA聚合酶 1具有 5-3聚合酶， 5-3外切核酸酶， 3-5化正外切核酸酶的活性。在 DNA 复制中，连续合成的子链成为前导链，另一条非连续合成的子链成为滞后链。是一种调节分子，被视为辅阻遏物，它与一种蛋白质结合形成全阻遏物 I.人类基因组测序的策略和主要步骤：步骤为建立遗传图谱建立物理图谱 DNA 序 列测定：测出人类基因组的全部序列基因的确定和分析：确定每一个基因，研究它的 特性、结构和功能。策略确定人类基因组研究的基本思路确定特定的基因利用 染色体特征研究人类基因組。
