1、ICS71.040.50N04中华人民共和国国家标准GB/T340592017纳米技术 纳米生物效应代谢组学方法核磁共振波谱法NanotechnologyNanobiologicaleffectsofnanomaterialsNMR-basedmetabolomics2017-07-31发布2018-02-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布目 次前言引言1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 缩略语15 原理16 仪器17 测试样品28 检测步骤29 信号归属210 信号的预处理和多变量统计分析211 测试分析结果3附录A(规范性附录) 缩略语
2、4附录B(资料性附录) 金纳米棒对细胞毒性评价实例5附录C(资料性附录) 纳米生物效应研究NMR检测报告格式11参考文献12GB/T340592017前 言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由中国科学院提出。本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口。本标准起草单位:中国科学院武汉物理与数学研究所、国家纳米科学中心。本标准主要起草人:张利民、王玉兰、唐惠儒、吴晓春。GB/T340592017引 言纳米材料通过呼吸、摄取、皮肤直接或间接接触等众多途径进入生物体,能够在细胞、亚细胞乃至分子水平影响生物体,引起生物体代谢改变。因此可以通过纳米材料暴露引起的生物
3、体代谢组改变来评价纳米材料的生物学效应。代谢组学研究是以组群指标分析为基础,以高通量检测和多变量数据统计分析为手段,以数学模型与系统整合为目标的学科,是系统生物学的一个分支学科,已经广泛应用于肿瘤、消化道疾病、代谢性疾病以及药物毒理等领域。目前代谢组学测试方法主要是色谱-质谱联用法和核磁共振波谱法,本标准制定基于核磁共振波谱法检测并用于评价纳米材料生物效应的代谢组学分析方法。GB/T340592017纳米技术 纳米生物效应代谢组学方法核磁共振波谱法1 范围本标准规定了纳米材料暴露引起生物体代谢组变化的核磁共振检测方法。本标准适用于纳米材料的生物效应评价。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应
4、用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T13966 分析仪器术语GB/T19619 纳米材料术语3 术语和定义GB/T13966和GB/T19619界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1代谢组学方法 metabonomics;metabolomics对生物体内代谢物组进行分析,并建立代谢物与生理病理变化的对应关系的组学方法1。3.2纳米材料暴露 nanomaterialsexposure纳米材料与人群或实验细胞和动物充分接触。4 缩略语见附录A。5 原理用质子NMR法检测经纳米材料暴露后
5、的生物样本,利用多变量统计分析代谢组学方法分析代谢物含量的变化,据此评估纳米材料生物效应。6 仪器6.1 高分辨核磁共振谱仪质子共振频率500MHz以上的NMR谱仪,参数优化建议参见附录B。1GB/T3405920176.2 核磁管用于NMR谱仪检测的样品管。7 测试样品纳米材料暴露后的生物样本,包括细胞、动物体液和组织等。8 检测步骤8.1 打开仪器,将装有待测试样的样品管置于NMR磁体内。8.2 设置待测样本温度(通常实验温度为25),等待至仪器稳定。8.3 锁场与调谐。8.4 调用仪器自带氢谱脉冲序列,根据不同生物样本选择合适的脉冲序列。8.5 参照仪器厂家提供的标准物质的谱峰半高宽,对
6、NMR谱仪进行匀场。8.6 优化并设定谱宽、脉宽、等待时间、采样点数、采样时间和扫描次数等测量参数。8.7 核磁共振信号采集。8.8 将仪器所测谱图保存,并记录仪器状态和测量数据。8.9 选取部分代表性样品进行二维NMR谱的采集并保存。9 信号归属代谢物的NMR信号通过一系列二维谱进行归属,并查阅相关文献和公共数据库进行归属验证。通常情况下,NMR信号包括糖类、氨基酸类、胆碱类、有机羧酸类、脂肪酸、核苷/酸类等代谢物。10 信号的预处理和多变量统计分析10.1 信号预处理应用核磁谱仪自带分析软件将核磁信号进行预处理,包括核磁谱图基线的校正、化学位移的定标、谱峰对齐和积分以及数据归一化。对于细胞
7、培养液和尿样宜采用总面积归一化;对于血浆样品宜采用不归一化或总面积归一化;对于细胞提取物、组织提取物和肠道提取物宜采用湿重归一化;对于肠道内容物提取和粪样提取宜采用干重归一化。10.2 数据预处理应用生物信息学软件将核磁数据进行标准化预处理,包括中心化处理、自适换算、帕累托换算等。主成分分析宜选择中心化处理方式。正交化偏最小二乘法判别分析宜选择自适换算或者帕累托换算。10.3 数据多变量统计分析10.3.1 概述包括非监督的模式识别方法和有监督的模式识别方法。10.3.2 非监督的模式识别方法将数据进行主成分分析(PCA)。主成分分析可以直观展示样品的聚集离散程度、是否存在异常点2GB/T34
8、0592017和组内分组趋势。10.3.3 有监督的模式识别方法将数据进行正交化偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA),并将OPLS-DA标准化处理后的数据进行回溯转换成负载图。10.4 统计模型验证10.4.1 概述主要包括内部验证和外部验证,确保后续数据分析结果的可靠性。10.4.2 内部验证主要采用交叉验证的方法。舍一法是最常用的一种交叉验证方法,即将样本总数的1/7作为验证集,6/7作为训练集。10.4.3 外部验证主要包括置换排列检验(PermutationTest)和变异系数方差分析(CV-ANOVA)两种方法。11 测试分析结果11.1 金纳米棒体外暴露的代谢组学测试,形态学与组
9、织病理学辅助评价及常规生化指标检测等生物效应评价实例参见附录B。11.2 纳米材料生物效应研究的核磁共振检测报告格式参见附录C。3GB/T340592017附 录 A(规范性附录)缩 略 语缩略语见表A.1。表A.1 缩略语缩略语中文名称英文名称NMR核磁共振NuclearmagneticresonanceCtr中心化mean-centeringandnotscalingUV自适换算AutoscalingandscaledtounitvariancePar帕累托换算ParetoscalingandscaledtoparetovariancePCA主成分分析Principalcomponents
10、analysisOPLS-DA正交化偏最小二乘法判别分析OrthogonaltopartialleastsquaresdiscriminantanalysisCV交叉验证CrossvalidationPR置换排列检验PermutationtestCV-ANOVA变异系数方差分析Coefficientofvariation-analysisofvarianceCTAB十六烷基三甲基溴化铵CetyltrimethylammoniumbromideDMEM达尔伯克(氏)必需基本培养基DulbeccosminimumessentialmediumHEPESN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸N-2-N-
11、2-hydroxyethylpiperazineethanesulfonicacidPBS磷酸缓冲液Phosphatebuffersolution4GB/T340592017附 录 B(资料性附录)金纳米棒对细胞毒性评价实例B.1 金纳米棒表征采用透射电子显微镜和紫外/可见吸收光谱仪分别表征了十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)修饰的金纳米棒的形貌(16.7nm62.5nm)和消光光谱特性,如图B.1所示。图B.1 透射电子显微镜(左)与紫外/可见吸收光谱仪(右)对金纳米棒的特性表征B.2 纳米材料体外(细胞)暴露实验步骤B.2.1 细胞培养本实例采用含10%胎牛血清DMEM培养基(不含HEPES
12、,不加抗生素),接种密度40%50%,温度为37,二氧化碳5%,培养48h,使细胞融合度接近100%。B.2.2 纳米材料暴露细胞培养融合度接近100%时,开始加入纳米材料溶液进行暴露实验,同时保留一组细胞样本作为平行对照组。实验过程中使用显微镜观察细胞生长情况并进行细胞计数,建议用于代谢组学分析的细胞个数约为109个,湿重约为100mg。金纳米棒暴露24h后,将细胞计数并收集。B.2.3 细胞收集首先用移液器移去培养基,加入5mL磷酸缓冲液(PBS)润洗,然后移除PBS,加入0.25%胰酶5mL消化细胞约2min5min。向细胞培养液中加入含血清培养基4mL使胰酶失活,将溶液转至15mL离心
13、管。加入4mL培养基再次润洗培养瓶,将溶液转至同一离心管。然后在温度为4,转速为800g情况下离心2min,除去上清液;加入4预冷的PBS3mL将培养皿冲洗3次,转速为800g情况下离心后除去上清液,收集细胞,准确称重后保存于-80超低温冰箱。5GB/T340592017B.2.4 细胞代谢物提取步骤提取步骤包括:a) 往细胞中加入体积比为12水/甲醇1mL混合溶液,混匀,采用液氮和37水浴分别冻融3次;b) 在冰浴条件下采用250W超声破碎细胞15min,超声方式为:超声1min,暂停1min,如此循环8次;c)在4,转速为3200g条件下离心10min后收集上清液;在细胞残渣中加入体积比1
14、2水/甲醇1mL混合溶液,混匀,采用液氮和37水浴分别冻融3次;d)在冰浴条件下采用250W超声破碎细胞15min,超声方式为:超声1min,暂停1min,如此循环8次;e)将上述2次收集的上清液汇入5mLEP管,在4,转速为3200g离心10min后收集上清液;f)采用真空浓缩仪除去甲醇,冷冻干燥除水,保存于-80超低温冰箱。B.3 纳米材料暴露前后的细胞形态学表征如图B.2所示,16HBE细胞和A549细胞在金纳米棒暴露48h后的荧光成像对细胞存活率。说明:绿色活细胞;红色死亡细胞(箭头所示)。图B.2 16HBE细胞(A)与A549细胞对照组(B)分别在CTAB表面修饰金纳米棒暴露48h
15、(C,D)后细胞的明场与荧光成像图6GB/T340592017B.4 常规生化指标检测根据实验对象,合理检测生化指标。本实例中,纳米材料暴露后导致细胞氧化应激损伤,而谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG),或GSH/GSSG的比值是氧化应激的生物标志物,因此采用生化方法或者核磁共振检测细胞内GSH/GSSG的比值及三磷酸腺苷(ATP)含量(图B.3)。说明:* 有显著性意义的p值小于0.05;*有显著性意义的p值小于0.01;*有显著性意义的p值小于0.001。图B.3 CTAB表面修饰金纳米棒暴露对A549细胞和16HBE细胞内不同暴露时间GSH与GSSG的比值及ATP含量的影响B.
16、5 细胞提取液代谢物NMR检测本实例中,细胞提取物使用一维的具有预饱和水峰照射的NOESY脉冲序列采集1HNMR谱。实验参数优化见表B.1。7GB/T340592017表B.1 实验参数的优化NMR参数名称NMR参数设置(预饱和水峰照射的NOESY脉冲序列)实验温度25谱宽20ppm脉宽10s等待时间2s混合时间100ms间隔时间3s采样时间1.36s采样点数32768累加次数64次空扫8次细胞提取物NMR信号检测并进行归属(图B.4)。说明:1脂肪;2亮氨酸;3异亮氨酸;4缬氨酸;5乳酸。图B.4 细胞提取物NMR谱图及部分信号归属8GB/T340592017B.6 NMR信号预处理后的多变
17、量统计分析B.6.1 主成分分析(非监督分析)图B.5主成分分析得分图显示金纳米棒导致不同细胞代谢组存在明显的分离趋势,并且数据集无异常点存在。图B.5 对照组(红色圆圈)与CTAB表面修饰金纳米棒暴露48h(黑色方框)时16HBE(A)和A549(B)主成分分析得分图B.6.2 偏最小二乘法判别分析(有监督分析)如图B.6所示为16HBE细胞对照组与CTAB表面修饰金纳米棒暴露24h的细胞其提取物的OPLS-DA得分图与其相关系数负载图。图形横坐标为NMR谱的化学位移,纵坐标为每个变量相关系数的绝对值(|r|),图形用不同颜色来表征代谢物对区分组间的贡献大小。颜色越红,则变量和分组变量的相关
18、系数(r)越大,表示该代谢物对区分组间的贡献越大;反之,颜色越蓝,r越小,则表示变量对区分组间的贡献越小。此外,通过皮尔森相关系数显著性差异检测(Pearsonsproduct-momentcorrelationcoefficient),并综合考虑组内样本数n(最少组的样本数),确定评估代谢物变化是否达到具有统计学差异的阈值(p0.05)。例如当n=10时,其相关系数的阈值rcutoff为0.602,即当代谢物信号的相关系数绝对值|r|0.602时,则代谢物的变化才具有统计学差异。图B.6 A549细胞对照组与CTAB表面修饰金纳米棒暴露48h的细胞其提取物的OPLS-DA得分图(左)与其相关
19、系数负载图(右)B.6.3 多变量分析模型验证置换排列实验结果显示16HBE细胞(A)和A549细胞(B)对CTAB表面修饰金纳米棒暴露48h9GB/T340592017时所建立的数学模型较好(图B.7)。其中绿色数据点代表排列实验中的R2值,蓝色数据点代表排列实验中的Q2值,任何一次随机排列产生的R2、Q2值均小于右端的原始值,表明原始模型的预测能力大于任何一次随机排列变量的预测能力,则该模型验证通过。说明:纵坐标 模型预测能力值;横坐标 排列实验随机率;绿色数据点R2值;蓝色数据点Q2值。图B.7 16HBE细胞(A)和A549细胞(B)对CTAB表面修饰金纳米棒暴露48h时模型的置换排列
20、实验另外,OPLS-DA模型的CV-ANOVA验证显示16HBE细胞(A)和A549细胞(B)对CTAB表面修饰金纳米棒暴露48h时的p值为1.6910-3,远小于0.05,表明所建立的数学模型较好。B.7 测试结果和金纳米棒细胞生物效应评价NMR检测并归属了包括亮氨酸、异亮氨酸、乳酸等代谢物;多变量统计分析发现金纳米棒暴露于正常细胞(16HBE)导致谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸含量显著升高,还原型谷胱甘肽含量显著下降,氧化型谷胱甘肽含量显著升高;然而,金纳米棒暴露于癌细胞(A549)后,细胞内谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸含量未见显著变化,还原型谷胱甘肽含量显著下降,大量的核苷酸含量显著下降。荧光成像
21、对细胞存活率的表征表明金纳米棒暴露于正常细胞(16HBE)显示细胞毒性较小,而暴露于癌细胞(A549)后显示明显的细胞毒性。01GB/T340592017附 录 C(资料性附录)纳米生物效应研究NMR检测报告格式纳米生物效应NMR检测报告报告编号:1 委托者名称: 地址:联系方式:2 测试样品名称: 编号:3 测试依据:4 NMR谱仪制造单位: 型号:5 NMR检测参数待测样品类型:温度:脉冲序列名称:采样时间:等待时间:谱宽:90度脉宽:扫描次数:采样点数:6 测试结果原始谱图:信号归属:多变量统计分析方法:模型验证方法:显著性变化的代谢物:有显著性变化代谢物的相关系数值:7 测试机构测试人
22、员:测试日期:机构名称:地址:11GB/T340592017参 考 文 献1 BeckonertO,KeunH.C.,EbbelsT.M.D,BundyJ.,HolmesE.,LindonJ.C.,NicholsonJ.K.Metabolicprofiling,metabolomicandmetabonomicproceduresforNMRspectroscopyofurine,plasma,serumandtissueextractsJ.NatureProtocols2007,2,2692-2703.21GB/T340592017710295043T/BG中华人民共和国国家标准纳米技术 纳米生物效应代谢组学方法核磁共振波谱法GB/T340592017*中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址:服务热线:400-168-00102017年8月第一版*书号:1550661-57197版权专有 侵权必究
