1、ICS 59.080 W 59 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3084 2018 羽绒制品中鹅绒的鉴别 PCR 法和实时荧光 PCR 法 Identification of Goose Down Fiber in Feather and Down Products -PCR method and real-time fluorescence PCR method 2018 - 12 - 25 发布 2019 - 01 - 25 实施 辽宁省市场监督管理局 发 布 DB21/T 3084 2018 I 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：
2、标准的结构和编写给出的规则编制。 本标准附录 A、附录 B 为资料性附录。 本标准由 中华人民共和国大连海关 提出并归口。 本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局 检验检疫技术中心 。 本标准主要起草人： 任亮 、 颜怀玉 、 孔平 、 王贵滨 、 肇慧君。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担 识别 这些专利的责任 。 DB21/T 3084 2018 1 羽绒制品中鹅绒的鉴别 PCR 法和实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了羽绒制品中鹅绒的 PCR 和实时荧光 PCR 鉴别方法。 本标准 适用于羽绒制品。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
3、。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 一种模拟天然 DNA 复制的体外扩增法，在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物 为延伸起点，以 4 种单核苷酸（ dNTP）为底物，通过变性 退火 延伸的循环反应，使极少量的 DNA 的 特定片段，在短短几小时内扩增上百万倍。 3.2 实时荧光 PCR real-time fluorescence polym
4、erase chain reaction 在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过曲线对未 知模板进行定量或定性分析的方法。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（ base pair） Ct 值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（ cycle threshold） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonuleic acid） DTT：二硫疏糖醇 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸 （ deoxyribonucleoside triphosphate） 5 原理 用试剂盒法 或其他等效 DNA 提取法 提取样品 中
5、的 DNA。针对鹅的线粒体 DNA 序列设计引物和探 针 ， 通过单 PCR、实时荧光 PCR 技术，对 DNA 中的鹅成分分别进行特异性扩增，根据实验结果，判 定样品中是否含有鹅绒。 DB21/T 3084 2018 2 6 试剂 6.1 实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 6.2 组织和毛发提取试剂盒 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa Code.9765)。参见附录 A 中 A.1。 6.3 Premix Ex Taq (Probe qPCR) (TaKaRa Code.
6、 RR390A) 参见附录 A 中 A.2。 6.4 100%乙醇。 6.5 溴化乙锭溶液。 6.6 DNA Laddar Marker。 7 设备 与 器具 7.1 PCR 仪 7.2 实时荧光定量 PCR 仪 7.3 电泳装置 7.4 凝胶成像仪 7.5 冰箱： 4 20 7.6 天平：精度为 0.0001 g 7.7 分析研磨机 7.8 微孔干浴器或水浴锅 7.9 瞬时离心机 7.10 涡旋混合器 7.11 1.5 mL 磁分离架 7.12 微量可调移液器： 0.1L2.5 L， 1 L 10 L， 2 L 20 L， 10 L 100 L， 20 L 200 L， 100 L 1000
7、 L。 7.13 1.5 mL 离心管 ， 2.0 mL 离心管 7.14 PCR 薄壁管 7.15 实时荧光 PCR 光学反应管 7.16 超净工作台 8 取样 从羽绒服或其他羽绒制品的不 同 部位取样， 混合均匀后， 再取 约 1 g 试样。 9 制样 将样品剪碎，经分析研磨机打散混匀，再 次 尽量剪碎至 2 mm 以下，再次用分析研磨机混匀。 10 DNA 的提取 10.1 组织裂解 DB21/T 3084 2018 3 称取约 5 mg 试样，放入 2 mL 离心管中，每个样平行提取 2 管，加入 180 L 的缓冲液 GL（ Buffer GL）、 20 L 的蛋白酶 K（ Prot
8、einase K）和 10 L 的核糖核酸酶 A（ RNase A， 10 mg/mL），于 56 水浴温浴至组织完全裂解 3 小时。如残存纤维状组织无法完全裂解，裂解之后先 12,000 rpm 离心 2 分 钟，去除杂质之后再进行后续操作 。向裂解液中加入 200 L 缓冲液 GB（ Buffer GB）和 200 L 100% 乙醇，充分吸打混匀。 注： 温浴时可时常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解。 10.2 将 核酸纯化柱 （ Spin Column）安置于收集管（ Collection Tube）上，溶液移至 核酸纯化柱 中， 12,000 rpm 离心 2 分钟，弃滤液。 10
9、.3 将 500 L 的缓冲液 WA（ Buffer WA）加入至 核酸纯化柱 中， 12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 10.4 将 700 L 的缓冲液 WB 加入至 核酸纯化柱 中， 12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 10.5 确认缓冲液 WB 中已经加入了指定体积的 100%乙醇。 10.6 沿 核酸纯化柱 管壁四周加入缓冲液 WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。 10.7 重复操作步骤 4。 10.8 将 核酸纯化柱 安置于 收集管 上， 12,000 rpm 离心 2 分钟。 10.9 将 核酸纯化柱 安置于新的 1.5 mL 的离心管上，在 核酸
10、纯化柱 膜的中央处加入 50 L 200 L 的 灭菌水或洗脱液（ Elution Buffer），室温静置 5 分钟。 10.10 将灭菌蒸馏水或洗脱液加热至 65 使用时有利于提高洗脱效率。 10.11 12, 000 rpm 离心 2 分钟洗脱 DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到 核酸纯化柱 膜的 中央或再加入 50 L200 L 的灭菌水或洗脱液，室温静置 5 分钟后， 12,000 rpm 离心 2 分钟洗脱 DNA。 11 DNA 的鉴别 11.1 质量控制 进行 PCR、实时荧光 PCR 鉴别时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：扩增鹅成分时 用鹅绒 DNA。
11、阴性对照：扩增鹅成分时用非鹅绒 DNA，空白对照：实验用水。 11.2 PCR 法 11.2.1 引物 所用引物信息 见表 1。 表 1 PCR 扩增所用引物 扩增成分 引物名称 引物序列 退火温度 / 产物大小 /bp 鹅 Goose-cytb-F 5 - GCTACTAGCCATACACTAC -3 60.3 375 Goose-cytb-R 5 - GTTGGATTGTCTACTGAGA -3 60.0 375 11.2.2 PCR 反应体系 premix Ex Taq (2) 12.5 L ， 10 mol/L 引物各 1 L ， DNA 模板 2 L ， ddH2O 8.5 L 11
12、.2.3 反应条件 95 ， 30 s； 95 ， 5 s， 退火温度 （见 表 1）， 60 ， 30 s， 40 个循环。 注： 不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。 DB21/T 3084 2018 4 11.2.4 PCR 产物的检测 将适量 5TBE 稀释成 0.5TBE 溶液，配制 2.0% 琼脂糖凝胶，取 15 L PCR 产物，点样进行电泳， 并加 DNA marker 点样以判断 PCR 产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在 3 V/cm5 V/cm 长度 ， 电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。电泳结束后，将凝胶置溴化乙锭溶液（ 10 g/L）中
13、浸泡 30 min。用凝胶成像 系统观察、拍照、记录与分析电泳结果。 11.2.5 PCR 结果及判断 阳性对照出现预期大小的扩增条带，阴性对照和空白对照均未出现条带；待测样品未出现预期大小 的扩增条带，判断结果为阴性。待测样品出现预期大小的扩增条带，判断结果为可疑阳性，需进一 步确证。 11.2.6 结果确证实验 可疑阳性结果的采用实时荧光 PCR 法进行确证。 11.3 实时荧光 PCR 法 11.3.1 引物及探针 所用的引物、探针见表 2。 表 2 实时荧光 PCR 所用引物、探针 扩增成分 引物名称 引物序列 退火温度 / 产物大小 /bp 鹅 Goose-cytb-F 5 - GC
14、TACTAGCCATACACTAC -3 60.3 375 Goose-cytb-R 5 - GTTGGATTGTCTACTGAGA -3 60.0 375 Goose-cytb-P 5 -（ FAM） CGCAGACACTTCACTCGCCT（ Eclipse） -3 70.0 375 11.3.2 PCR 反应体系 Premix Ex Taq (2) 12.5 L ， Premix Ex Taq (2) 12.5 L， Primer F (10 M) 1 L， Primer R (10 M) 1 L ， Probe (5 M) 1 L， DNA2 L ， dH2O7.5 L， Negati
15、ve control 反应时，加入 RNase free dH2O， Positive 反应时，做 2 个平行样。 11.3.3 PCR 反应条件 95 ， 30 s； 95 ， 5 s，退火温度（ 见 表 2）， 60 ， 30 s， 40 个循环。 注： 不同仪器可根据仪器要求和 Premix Ex TaqTM 使用说明书将反应参数作适当调整。 11.3.4 结果分析 反应结束后，应 设置无效基线范围，基线范围选择在 315 个循环，如果有强阳性样本，应根据实 际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且 Ct 值 =40 为 准。设置阈值后，分析样品的检
16、测结果。 11.3.5 结果判断 待测样品鹅成分检测 Ct 值大于或等于 40，内参照基因检测 Ct 值在 2330 之间者，阴性对照、阳性 对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出鹅 源性 DNA 成分。 DB21/T 3084 2018 5 待测样品鹅成分检测 Ct 值小于或等于 36，内参照基因检测 Ct 值在 2030 之间者，阴性对照、阳性 对照和空白对照结果正常者， 则可判定该样品检出鹅 源性 DNA 成分。 待测样品鹅成分检测 Ct 值在 3640 之间，应重做实时荧光 PCR 扩增。再次扩增后的结果 Ct 值仍小 于 40 者，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可
17、判定该样品检出鹅 源性 DNA 成分 ； 再次 扩增后结果 Ct 值大于 40， 且阴性对照 /阳性对照和空白对照结果正常 ， 可判定该样品未检出鹅 源性 DNA 成分。 11.4 结果表述 该样品未检出鹅源性 DNA 成分 ， 该样品检出鹅源性 DNA 成分 。 12 防止污染的措施 检测过程中防止交叉污染的措施参照 GB/T 19495.2。 DB21/T 3084 2018 6 A A 附 录 A （资料性附录） 试剂 盒 A.1 试剂盒 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa Code.97
18、65) 组成（ 50 次） 本试剂盒分试剂 Part I 与 Part II 两部分。 Part I -20 保存 蛋白酶 K（ proteinase K， 20 mg/mL） 1mL 核糖核酸酶 A（ RNase A， 10 mg/mL） 0.5mL Part II 室温（ 15-25 ）保存 缓冲液 GL（ Buffer GL） 1 12mL 缓冲液 GB（ Buffer GB） 1 12mL 缓冲液 WA（ Buffer WA） 1 28mL 缓冲液 WB（ Buffer WB） 2 24mL 洗脱液（ elution buffer） 14mL 离心管（ Spin Columns） 50
19、 支 收集管（ Collection tubes） 50 支 A.2 试剂盒 Premix Ex Taq (Probe qPCR) (TaKaRa Code. RR390A) 组成（ 50 L 反应 200 次） Premix Ex Taq（ Probe qPCR）（ 2Conc. ） 11.0m L5 支 ROX Reference Dye（ 50Conc. ） 2200L1 支 ROX Reference DyeII（ 50Conc. ） 2200L1 支 非商业 性声明：附录 A 所列参考试剂盒仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试使 用不同厂家或型号的试剂盒及试剂。 DB2
20、1/T 3084 2018 7 B B 附 录 B （资料性附录） 扩增产物序列 鹅扩增产物序列（ 375bp） Attcctagccatgcactactcaccagacgcctcaaccgccttttcatcaatcgcccacatcactcgagacgtaaattatggctga atcatccgctaccttcacgccaatggcgcctcaatattctttatctgcctcttcctacacatcgggcgaggcctatattacggatcatt tctctactcagaaacctgaaacatcggcattatcctcctgcttgcaactatagcaacagccttcataggctatgtcctcccgtgaggcc aaatatcattctgaggggccacagtaattacaaacttactatccgccatcccatacattgggacagacctagttcaatgaatctgagga ggctactcagtagacagtcccac DB21/T 3084 2018 8 参 考 文 献 1 国家质量监督检验检疫总局 .GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 S.2004-4-21. _
