1、ICS 65.150 B 51 DB21 辽宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3120 2019 水产动物物种分子鉴定 COI、 16S rRNA 分子标记法 Technical specification for species molecular identification using COI and 16S rRNA of aquatic animals 2019 - 02 - 28 发布 2019 - 03 - 28 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3120 2019 I 前 言 本标准依据 GB/T 1.1 2009给 出的规则制定。 本标准由 大连市质量技术监
2、督局 提出。 本标准由 辽宁省农业农村厅 归口。 本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。 本标准主要起草人：高磊、赫崇波、鲍相渤、高祥刚。 附录 A、 B、 C为资料性附录 。 DB21/T 3120 2019 1 水 产动物物种分子鉴定 COI、 16S rRNA 分子标记法 1 范围 本 方法 规定了水产动物物种 分子 鉴定 COI、 16S rRNA分子 标记法 的 相关 术语 和 定义 ， 标记方式 ， 试剂、仪器 和 设备 ， 样品采集 、 保存 和前处理 ， DNA提取和检测 ， 序列扩增 和 测序 ，以及 物种 鉴定 的 方法 。 本 方法 适用于水产动物物种 分子 鉴定
3、 COI、 16S rRNA分子 标记法 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验 室用水规格和试验方法 3 术语 和 定义 下列术语 和 定义适用于本文件。 3.1 水产动物 物种 分子 鉴定 aquatic species molecular identification 指利用分子生物学手段 ,对水产动物样本（尤其适用于形态学特征相近、模糊或丢失的样本） 的分 子标记 进行分析， 鉴定生物种类 的 过程 。 3.2
4、聚合酶链式反应 polymerase chain reaction（ PCR） 用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（ dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热 DNA 聚合酶催化下，在体外人工合成特异 DNA片段的过程。 3.3 DNA序列测定 DNA sequencing 测定 DNA分子的核苷酸序列。 3.4 序列比对 alignment 为确定两个或多个序列之间的相似性和同源性，将他们按照一定的规律进行排列。 3.5 DB21/T 3120 2019 2 DNA条形码 -COI 细 胞色素 c氧化酶亚基 I（ cytochrome c coxidase subunit I）
5、。 3.6 16S rRNA 16S核糖体核糖 核酸 （ 16S ribosomal RNA） 。 4 标记方式 水产动物 的 COI和 16S rRNA的 DNA序列进化速度较快，同时又相对保守，可作为分子 标记 条形码用于 物种鉴定。通过 PCR技术扩增水产动物的 COI和 16S rRNA基因部分序列，测序后在已知数据库中进行序列 比对，确定物种分类信息。本 方 法 同时对 COI和 16S rRNA两种分子 标记 条形码进行分析，并在 GenBank （ https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank） 和 BOLD System（ http:/www.bold
6、systems.org） 两个数 据库中比对， 确保 鉴定成功率和准确率。 5 试剂、仪器和设备 5.1 试剂 实 验 仅使用分析纯试剂 ，水应符合 GB/T 6682一 级水要求。主要包含以下内容： 无水乙醇 ； 95 %乙醇 ； TE缓冲液（ pH 7.6）（ 100 mol/L Tris-Cl， pH 7.6； 10 mmol/L EDTA， pH 8.0） ； Taq酶（ 5 U/L ） ； 超纯水 ； 10PCR 缓冲液（ 500 mmol/L KCl； 100 mmol/L Tris-Cl， pH 8.3； 15 mmol/L MgCl2） ； 引物（ 10 mol/L ） ； d
7、NTP混合液（每种脱氧核糖核苷三磷酸浓度 2.5 mmol/L） ； 溴化乙锭（ 10 mg/mL） ； 琼脂糖 ； 电泳 标记物 （ markers） ； 平衡酚 ； 氯仿 /异戊醇（ 24:1） ； 10 Tris硼酸 （ 10 TBE） 电泳缓冲液 ； 灭菌蒸馏水； 液氮； 细胞裂解液（ 20 mmol/L） 。 5.2 仪器和设备 实验用仪器和设备主要包含以下内容： 凝胶成像分析系统 ； PCR 仪 ； 低温高速离心机 （ 4 ， 12000转 ） ； DB21/T 3120 2019 3 稳压稳流电泳仪 ； 单道可调移液器 ； 电子天平 （ 0.001 g） ； 水浴恒温震荡器 ；
8、电泳槽 ； 紫外分光光度计 ； 遗传分析仪 。 6 样品采集 、 保存 和前处理 6.1 样品采集 、保存 样本采集和后续实验应在生物安全实验室进行。 选 择 DNA含量高、多糖等含量低的 肌肉、 肠道、 体腔液、 鱼鳍等 组织进行采样，样品可通过 -20 冷冻、 或 4 冰鲜 等方式 暂时保存。 6.2 样品 前处理 将样品 切成 5 mm左右直径的小块或薄片，用灭菌蒸馏水洗净， 按 1:10左右比例将样品 放入盛有 95 % 乙醇的离心管中， 4 保存 。 7 DNA 提取和检测 7.1 DNA 提取 7.1.1 取 0.1 g 左右样品置于陶瓷研钵中，加少许液氮研碎。将粉末转入 400
9、L 500 L细胞裂解液 离心管 中， 37 温浴 1 h后转入 50 水浴 3 h，期间经常摇 动。 7.1.2 反应液冷却后加 500 L 平衡酚，缓慢颠倒 10 min混匀。 12000 rpm离心 15 min，转上层水相于 新离心管中（重复此过程一次） 。 7.1.3 加氯仿 /异戊醇 450 L ，混匀后 12000 rpm 离心 10 min。转上层水相于新离心管中，加 1/10体 积 3 mol/L NaAc和 2.5倍体积无水乙醇，混匀，置于 -20 环境下 1 h。 7.1.4 12000 rpm离心 15 min，弃上清。以 70 %冷乙醇洗涤 12次，真空抽干或自然吹干
10、，加入 TE 缓 冲液溶解， -20 保存。 7.2 DNA 检测 7.2.1 纯度检测 吸取 1 L 3 L DNA，琼脂糖凝胶 100 V电泳 30 min，如条带整齐、亮度 高，则纯度满足实验要求。 7.2.2 浓度检测 分别 于 260 nm和 280 nm波长下测定 DNA的紫外吸收值。 DNA浓度 (g/mL)=A260 /(0.020 L) 稀释 倍数，式中 L为比色池厚度，单位 cm。 DNA浓度在 10 g/mL 以上时进 行后续实验。 8 序列扩增 和 测序 DB21/T 3120 2019 4 8.1 引物 水产动物 PCR扩增引物 参 见附 录 A。 8.2 PCR 扩
11、增 PCR扩增 应在以下体系和条件下进行： PCR扩增体系： 10PCR 缓冲液 10 L 、上下游引物各 1 L 、 DNA提取液 5 L 、 Taq酶 0.5 L ， dNTP混合液 8 L 、超纯水定容至 50 L ； PCR扩增条件：一个循环反应（ 95 5 min）， 30个循环反应（ 94 30 s， 50 30 s， 72 60 s）， 72 10 min，结束 PCR反应。 8.3 测序 利用遗传分 析仪对 PCR产物进行双向测序，得到 DNA序列信 息。 9 物种鉴定 9.1 序列比对鉴定 将 COI基因序列在 GenBank和 BOLD System中进行核苷酸序列比对，将
12、 16S rRNA基因序列在 GenBank 中进行核苷酸序列比对。比对结果认定如下： 序列 比对检出 标准为序列 相似度 99%； 综合 COI和 16S rRNA 的比对结果形成最终鉴定结果； 若出现 2 个及以上 比对 结果，则选取相似度高且结果一致的鉴定物种作为鉴定结果 ； 对于鉴定成功的样本，记录于水产动物物种 分子 鉴定记录表（见附录 B） ； 对于无匹配结果，或结果矛盾的 样本 ，作为未检出样本处 理。 9.2 未检出样本 未检出样本记 录于未检出水产动物分类记录表（详见附录 C） 。 DB21/T 3120 2019 5 A A 附 录 A （资料性附录） 水产动物物种 分子
13、鉴定 PCR 扩增引物 表 A.1 水产动物物种 分子 鉴定 PCR扩增 引物 物种 引物序列 COI 基因 PCR 扩增引 物 硬骨鱼纲 软骨鱼纲 F: 5-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3 R: 5-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3 甲壳纲 F: 5-TATTATTAGACAAGAATCTGGTAAA-3 R: 5-AGGAAATGTTGAGGGAAGAAAGTAA-3 双壳纲 腹足纲 F: 5-ACAAATCAYAARGAYATYGG-3 R: 5-ACCAATCATAAA
14、GATATTGG-3 头足纲 F: 5-ACAAAYCATAAAGAYATTGG-3 R: 5-GTAAATATATGRTGGGCTCA-3 海参纲 海胆纲 海星纲 F: 5-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3 R: 5-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3 钵水母纲 F: 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC-3 R: 5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 哺乳纲 F: 5-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3 R: 5-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGG
15、TGACCGAAGAATCAGAA-3 爬行纲 F: 5-ACTCAGCCATCTTACCTGTGATT-3 R: 5-TGGTGGGCTCATACAATAAAGC-3 通用 （选用） F: 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 R: 5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 16S rRNA 基因 PCR 扩 增引物 通用 （除甲壳 纲和头足 纲） F: 5-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3 R: 5-TCCATAGGGTCTTCTCGTC-3 甲壳纲 F: 5-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3 R: 5-TCCATA
16、GGGTCTTATCGTC-3 头足纲 F: 5-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3 R: 5-TCCATAGGGTCTTTTCGTC-3 注： COI基因 PCR扩增引物 可选用特异引物或通用引物。 DB21/T 3120 2019 6 B B 附 录 B （资料性附录） 水产动物物种 分子 鉴定记录表 表 B.1 水 产动物物种 分子 鉴定记录表 鉴定人 ；地点 ； 时间 年 月 日 时 分至 年 月 日 时 分 序号 样本编号 样品名称 样品来源 鉴定结果 备注 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 记事： 采样人 记录人 校对人 DB21/T 3120 2019 7
17、C C 附 录 C （资料性附录） 未检出水产动物分类记录表 表 C.1 未检出水产动物分类记录表 鉴定人 ；地点 ； 时间 年 月 日 时 分至 年 月 日 时 分 序号 样本编号 样品名称 样品来源 未检出结果 备注 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 记事： 采样人 记录人 校对人 _ DB21/T 3120 2019 1 参 考 文 献 1 Mitani T, Akane A, Tokiyasu T, et al. Identification of animal species using the partial sequences in the mitochondrial 1
18、6S rRNA gene. Legal medicine, 2009, 11: S449-S450. 2 Lakra W S, Goswami M, Gopalakrishnan A. Molecular identification and phylogenetic relationships of seven Indian Sciaenids (Pisces: Perciformes, Sciaenidae) based on 16S rRNA and cytochrome c oxidase subunit I mitochondrial genes. Molecular Biology Reports, 2009, 36(5): 831-839. 3 National Center for Biotechnology Information (US), https:/www.ncbi.nlm.nih.gov. _
