1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3257 2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体 酶联免疫检测方法 Method of ELISA for PRRSV antibody NEQ 2020 - 04 - 30 发布 2020 - 05 - 30 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3257 2020 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 缩略语 . 1 4 原理 . 1 5 仪器和器材 . 1 6 试剂 . 2 7 操作步骤 . 2 8 试验成立条件与结果判定 . 3 9 检测过程中防止交叉污染的
2、措施 . 3 10 废弃物处理 . 3 附 录 A（资料性附录） 试剂配制 . 4 DB21/T 3257 2020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出的规则起草。 本标准由动物卫生标准化技术委员会（辽宁）提出，辽宁省农业农村厅归口管理。 本标准起草单位：辽宁省农业发展服务中心。 本标准协助单位：洛阳现代生 物技术研究院有限公司、辽宁佰 瑞生物科技有限公司。 本标准主要起草人：周晨阳、魏澍、高志峰、魏园园、王冰、董娜、刘金玲、刘耀川、杨作丰、高 原、王连山、马亮亮、潘婷婷、杨嵘长、姜斌、杨太东、于春玲。 本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电
3、和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街 2号），联系电话： 024-23447862； 标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路 105号甲），联系电 话 ： 024-24229579。 DB21/T 3257 2020 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法 1 范围 本标准规定了猪 繁殖与呼吸综合征 病毒抗体酶联免疫检测方法的技术要求。 本标准适用于 在生物安全 级（ BSL-2）以上的实验室进行 猪 繁殖与 呼吸综合征病毒病的诊断、 监测及流行病学
4、调查，适用于猪血清或血浆样品中的猪 繁殖与呼吸综合征 病毒抗体检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实 验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测 实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 ELISA：酶联免疫吸附测定（ enzyme linked immunosorbent assay） PRRSV：猪 繁殖与呼吸综合征 病毒（ Porcine Reproductive and R
5、espiratory Syndrome Virus） PBS：磷酸盐缓冲液（ phosphate buffer solution） OD：光密度，表示被检测物吸收掉的光密度（ optical density） 4 原理 本方法原理是包被板上包被的猪 繁殖 与呼吸综合征病毒（ PRRSV）抗原，可与待测样品中的特异 性抗体反应，形成抗原 -抗体复合物，再加入酶标记的二抗，则形成免疫复合物，洗涤后，如待测样品 中含有 PRRSV抗体，显色深，为阳性，反之为阴性。 5 仪器和器材 5.1 微量可调移液器： 50 L 200 L。 5.2 5mL 采血针管 5.3 冰箱： 4 1 冰箱， -20 1
6、冰箱。 5.4 酶标仪 5.5 37 恒温培养箱 5.6 高速台式离心机（离心范围 0 20 000r/min） 5.7 洗板机 5.8 离心管： 4 mL 离心管、 2 mL 离心管和 1.5 mL 离心管。 DB21/T 3257 2020 2 6 试剂 注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为分析纯或生化试剂；所有试剂均用无 菌的容器分装。 6.1 猪 繁殖 与呼吸综合征病毒抗原包被板。 6.2 阳性对照：猪 繁殖与呼吸综合征 病毒抗体阳性 猪 血清。 6.3 阴性对照：无猪 繁殖与呼吸综合征 病毒抗体猪血清。 6.4 酶标复合物 ：过氧化物 酶 标记的抗猪
7、繁殖 与呼吸综合征病毒单克隆抗体。 6.5 PBS：磷酸盐缓冲液（ 0.01 mol/L pH 7.4）配制见第 A.1 章。 6.6 洗涤液：配制见第 A.2 章。 6.7 样品稀释液：配制见第 A.3 章。 6.8 底物溶液：配制见第 A.5 章。 6.9 终止液：配制见第 A.6 章。 7 操作步骤 注：试验操作过程中涉及生物安全的注意事项依据 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 的规 定执行。 7.1 样品的采集、前处理与存放 7.1.1 采样注意事项 采集样品及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。 7.1.2 采样工具 5 mL采血针管和 4 mL、 2 mL
8、和 1.5 mL离心管经 1211 高压灭菌 20 min。 7.1.3 样品的 采集与前处理 采集血 液 ，用离心机分离上清血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染。试验前将被检血清统一 编号，并用样品稀释液作 40 倍稀释。 7.1.4 存放 前处理后的样品 密封 装于灭菌 离心管 内， 4 或 -20 保存或立即检验。 7.2 ELISA 检测 7.2.1 在使用前，所有的试剂盒组份应恢复到 18 26 。试剂应轻轻旋转或振荡混匀。 7.2.2 取出包被板，加入 100 L没有稀释的阴性对照和阳性对照，每次检测各加两孔；在相应的孔中 加入 100 L已经稀释好的样品。 7.2.3 在 37
9、 条件下温育 30 min（ 1 min）。 7.2.4 将各孔的液体弃入废液 桶 ，用 300 L洗涤液洗涤板孔，共洗涤 5 次。每次洗涤后应弃去孔内的 液体。在最后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。 7.2.5 每孔加入 100 L酶结合物。 7.2.6 在 37 条件下温育 20 min（ 1 min）。 7.2.7 重复步骤 7.2.4。 7.2.8 每孔加入 50 L显色液 A 和 50 L显色液 B（也可显色液 A、 B 等比例混匀后加 100 L）。 DB21/T 3257 2020 3 7.2.9 在 37 条件下温育 10 min（ 1 min）。 7.2.
10、10 每孔 加入 50 L终止液，终止反应。测量并且记录样品和对照的 OD 值（ 450 nm）， 15 min 内读值有效。 8 试验成立条件与结果判定 8.1 试验成立条件 阴性对照平均值（ NCX ） NCX =( NC1+NC2 )/2 阳性对照平均值（ PCX ） PCX =( PC1+PC2 )/2 试验成立判断标准： PCX -NCX 0.5； NCX 0.3。 如果试验无效，试验中的操作值得怀疑，应按照操作说明书重做一次试验。 8.2 结果判定 样品的计算 S/P=(样品 NCX )/( PCX NCX ) 如果样品 S/P 值 0.2，样品应判定为抗体阴性。 如果样品 S/P
11、 值 0.2，样品应判定为抗体阳性。 9 检测过程中防止交叉污染的措施 按照 GB/T 19495.2-2004的规定执行。 10 废弃物处理 按照 农业部关于印发 病死及病害动物无害化处理技术规范 的通知（农医发 2017 25号 ) 规定执行。 DB21/T 3257 2020 4 附 录 A （ 资料 性附录） 试剂配制 A.1 磷酸盐缓冲液（ PBS， 0.01 mol/L pH 7.4） 氯化钠 8 g 氯化钾 0.2 g 磷酸二氢钾 0.2 g 十二水磷酸氢二钠 2.83 g 蒸馏水 加至 1 000 mL A.2 洗涤液 PBS 1 000 mL 吐温 -20 0.5 mL A.3 样品稀释液 含体积分数为 10%新生猪血清的洗涤液 A.4 磷酸盐 -柠檬酸缓冲液（ pH 5.0） 柠檬酸 3.26 g 十二水磷酸氢二钠 12.9 g 蒸馏水 700 mL A.5 底物溶液 用二甲基亚砜 3355 -四甲基 联苯胺（ TMB）配成 1%质量浓度， 4 保存。使用时按下列配方 配制底物溶液。 磷酸盐 -柠檬酸缓冲液 9.9 mL 1%3355 -四甲基联苯胺 0.1 mL 30%双氧水 1 L A.6 终止液 浓硫酸 0.31 mL 蒸馏水 100 mL _
