1、lCS 11220B 41 a园中华人民共和国国家标准GBT 1 8090-2008代替GBT 18090 2000猪繁殖与呼吸综合征诊断方法Diagnostic methods of porcine reproductive and respiratory syndrome200812-31发布 200905-01实施宰瞀鹳零瓣警矬赞翼发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 罱GBT 1 8090-2008本标准的修订参照了世界动物卫生组织(OIE)编写的陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽与蜜蜂)(第五版，2004)。其技术内容与OIE所推荐的基本一致。本标准代替GBT 18090 20
2、00猪繁殖和呼吸综合症诊断方法。本标准与GBT 18090 2000相比主要变化如下：增加了临床诊断；免疫过氧化物酶单层试验作连续4倍稀释，结果的判定按照OIE编写的陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽与蜜蜂)(第五版，2004)的内容作了相应的修改；一一增加了反转录聚合酶链反应试验。本标准的附录A、附录B是规范性附录，附录C是资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙颖杰、苏永生、胡传伟、吴斌、李叶、贾贽、肇惠君。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：一一GBT 1809
3、0 2000。1范围猪繁殖与呼吸综合征诊断方法GBT 18090-2008本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征(PRRs)的诊断方法。本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本标准。bp碱基对
4、；CPE致细胞病变作用；DEPC一一焦碳酸二乙酯；dNTP一脱氧核苷三磷酸；EB溴化乙锭；HRP辣根过氧化物酶；IFA一间接免疫荧光试验；IPMA一免疫过氧化物酶单层试验；PBS一一磷酸盐缓冲盐水PRRs猪繁殖与呼吸综合征；RNA核糖核酸；RTPcR反转录一聚合酶链反应；Taq酶Thq DNA聚合酶。4临床诊断急性感染初期，猪群表现为食欲低下、发热、昏睡和精神不振等症状，个别猪可出现双耳、外阴、腹部、口部青紫发绀，一般持续1周3周；发病高峰的主要特征是母猪早产、流产以及木乃伊胎和弱仔增多；仔猪断奶前死亡率增加，高峰期一般持续8周12周；发病末期，母猪繁殖功能逐渐恢复，达到或接近病前水平。仔猪和
5、育肥猪存在不同程度的呼吸系统症状，痊愈猪一般生长缓慢，体重较轻。若没有继发感染，除发病仔猪可见间质性肺炎等特征病变外，一般不表现肉眼可见病变。有以上临床症状者，可以怀疑猪群有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染，确诊需要实验室检验。IGBT 18090-20085病毒的分离与鉴定51材料准备511器材二氧化碳培养箱、普通冰箱及低温冰箱、倒置生物显微镜、恒温水浴箱、离心机及离心管、96孔细胞培养板、微量移液器、组织研磨器、孔径o2 pm的微孔滤器及滤膜。512试剂RPMI 1640细胞培养液、MEM细胞培养液、犊牛血清、青霉素(104 IumL)与链霉素(104 pgmL)溶液、75碳酸氢钠
6、溶液等。513细胞猪原代肺泡巨噬细胞培养物(PAM)、MARC-145。PAM由未感染过PRRS猪群中6周龄8同龄的猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法见附录A。514样品5141采样无菌采取扁桃体、肺、淋巴结和脾等组织，血清或腹水置低温保存盒内立即送检。不能立即检测者，应放一20冰箱中，长期保存应置于一70冰箱中。514，2制备血清和腹水可直接检测。肺、脾和扁桃体等组织可单独检测，也可混合后检测。各组织剪碎后研磨成糊状，加入RPMll640，制成10的组织悬液，以3 000 rrain离心15 min，吸取上清液，加入青霉素500 IUmL、链霉素500 pgmL、庆大霉素500 pgm
7、L和两性霉素B 200 pgmL。怀疑有细菌污染的样品，也可用02 pm微孔滤膜过滤处理。52操作方法521制备细胞板已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离株特别是欧洲型病毒株的生长，因此病毒分离应首选PAM细胞，先将PAM细胞用RPMll640稀释(含犊牛血清5，青霉素100IUmL、链霉素100 pgmL、庆大霉素50 pgmL、两性霉素B 10 pgmL，pH72)，稀释细胞终浓度为每毫升1 X 106个细胞。或将MARC一145用MEM稀释，使细胞终浓度为每毫升5104个细胞。然后，每孔100 pL加入到96孔细胞培养板中。522稀释样品在空白96孔细胞培养板中加入细胞培养液RPMll
8、640，每孔90 pL，在A排和E排各孔内分别加入样品，每孔10 vL(样品l：10稀释)，将板轻轻摇动后，从A排和E排孔各取10 pL分别移入B排和F排孔内(样品1：100稀释)。将板轻轻摇动后，从B排和F排孔各取10 pL分别移人C排和G排孔内(样品1；1 000稀释)，将板轻轻摇动后，从C排和G排孔各取10 pL分别移入D排和H排孔内(样品1：10 000稀释)。每个培养板应设置空白对照。振动稀释板后加盖，置4冰箱内保存备用。523接种样品分别吸取上述稀释样品50 pL接种于521中对应的细胞孔(第一代)中，放人37、5二氧化碳培养箱中培养，每天观察CPE，连续观察2 d5 d。524培
9、养物盲传一般在第一代培养2 d后，不论有无细胞病变，一律将每孔内细胞液取25 pL，整板移人按照521方法制备的新细胞板对应的孔内。放入37、5二氧化碳培养箱中培养2 d5 d，每天观察CPE。53结果判定通常在接种1 d2 d后可出现CPE，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落。初次接种样品和盲传后都出现CPE，或盲传后出现CPE均认为阳性。仅仅初次接种样品出现CPE，认为是由于病2GBT 1 8090-2008料毒性引起的假阳性。在细胞培养物盲传结束后，不论是否出现CPE，对所有的孔应采用免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)或间接免疫荧光试验(IFA)进行终判；只要对PRRSV标准阳性
10、血清呈现阳性反应，则被认定为PRRSV分离阳性。6免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)61材料准备611器材微量移液器、倒置显微镜等。612试剂6121 IPMA诊断板的制备：见第A6章。6122标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪IgG HRP结合物使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。6123洗涤液、血清稀释液和显色底物溶液按照附录B配制。613样品采集被检猪血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4或一20冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号。62操作方法621 稀释血清样品：在空板的A排和E排各孔分别加人180 pL的血清稀释液，其余各孔加120
11、 PL。将20 pL被检血清和对照血清分别加入A排和E排各孔，缓慢摇动，从A排和E排各孔内取40 pL分别加入B排和F排，依次作1：40、1：160、1：640稀释。622取上述板中稀释血清样品各50 gL加入IPMA诊断板的相应孔内，封板，37孵育1 h，弃去液体，用015 molmL氯化钠(NaCl)+05吐温一80洗板三次。623用015molLNaCl和o5吐温一80稀释兔抗猪IgGHRP结合物至工作浓度，加入50 pL结合物稀释液于板中，封板后37孵育1 h，洗涤三次。624各孔中加入显色剂底物(AEc)溶液50 pL，在1822室温下作用至少30 min，弃去液体，加入50 pL
12、005 molL乙酸钠溶液。63结果判定将IPMA诊断板置于倒置显微镜下判读。在对照样品成立的前提下，被检血清标本板内各孔约3050的细胞质呈现深红色，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性，记作IPMA(+)；细胞质未被染色，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA(一)。血清非特异性反应使整孔细胞染色(与阳性对照比较)。血清滴度以50以上的孔染色的最高稀释度的倒数表示。血清滴度10为阴性，10或40为弱阳性，非特异性染色常在此范围内，血清滴度160为阳性。7 间接免疫荧光试验(IFA)71材料准备71器材荧光显微镜、二氧化碳培养箱、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。712试剂7121 IFA诊
13、断板的制备：见第A7章。7122兔抗猪IgG异硫氰酸荧光素(FITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清。713样品被检血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，试验前用PBS作20倍稀释。GBT 1 8090-200872操作方法721在96孔板中每孔加入PBS 190 ILL，再分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清10 pL(1：20稀释)。722 96孔板IFA操作步骤7221取96孔IFA诊断板，加入150 ktL PBS，室温浸润5 rain，弃去板中液体，并在吸水纸上轻轻拍干。7222在96孔IFA诊断板的感染和非感染细胞孔内分别加入50 pL 721中稀释的血清，封板后，湿盒中37作用3
14、0 rain，弃去板中血清，在吸水纸上轻轻拍干。每孔加入PBS 200 pL，洗板六次，弃去液体。7223每孔加人工作浓度的兔抗猪IgG FITC结合物50 pL，在37湿盒中作用30 min。7224弃去板中结合物，用PBS洗涤四次后，最后在吸水纸上轻轻拍干。用荧光显微镜观察。73结果判定在对照血清成立的前提下进行，即标准阳性血清对照中感染细胞孔应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔不出现荧光标准阴性血清对照感染细胞孔和未感染细胞孔均不出现荧光。被检血清中未感染细胞孔不出现荧光，感染细胞孔出现绿色荧光，判为阳性；未感染细胞和感染细胞中都没有特异性绿色荧光，判为阴性。任何血清在1：20稀释条件
15、下出现可疑结果时应重新检测，或2周3周后重新采样进行检测，重复检测仍为可疑，判为阳性。8间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)81材料准备811器材96孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿盒等。81 2试剂8121 PRRSV抗原和正常细胞对照抗原、兔抗猪IgG HRP结合物(简称酶标抗体)、标准阳性血清和标准阴性血清。使用前按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。8122抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等的配制，见附录B。813样品被检血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，试验前用血清稀释液作1：20稀释。82操作方法821 取96孔微量反应板，于奇数列
16、加工作浓度的病毒抗原，偶数列加工作浓度的对照抗原，每孔100”L，封板，置湿盒内37恒温箱中感作60 min，置4冰箱内过夜。822弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔300 pL，洗涤三次，每次1 rain。在吸水纸上轻轻拍干。823每孔加入封闭液100 pL，封板后置湿盒内37恒温箱中感作60 min。824洗涤，方法同822。825反应板编号后，对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。每份血清各加2个病毒抗原孔和2个对照抗原孔，孔位相邻。每孔加样量均为100 pL。封板，置保湿盒内于37恒温箱中感作30 min。826洗板，方法同822。827每孔加工作浓度的酶标抗体100
17、 pL，封板，放保湿盒内置37恒温箱中感作30 rain。828洗板，方法同822。829每TL自r1人新配制的底物溶液100 pL，封板，在37恒温箱中避光感作15 min。4GBT 18090-20088210每孔加终止液100 pL终止反应。83光密度(oD)值测定在酶标测定仪上读取反应板各孔溶液的OD值，记人专用表格。84结果判定841有效性判定阳性对照OD值与阴性对照OD值的差值应大于或等于015时，才可进行结果判定。否则，本次试验无效。842判定标准与解释a)SP比值小于03，判定为PRRSV抗体阴性，记作间接ELISA(一)；b)sP比值大于或等于03，小于04，判定为可疑，记作
18、间接ELISA(士)；c)SP比值大于或等于0。4，判定为PRRSV抗体阳性，记作间接ELISA(+)。判定为可疑样品，可重复检测一次，如果检测结果仍为可疑，可判作阳性；也可以采用其他血清学检测方法进行检测。注：间接ELISA试验也可采用经过验证的商品化检测试剂盒。9 反转录一聚合酶链反应试验(RPCR)91仪器与器材PCR检测仪，高速台式冷冻离心机(离心速度12 000 rrnin以上)，台式离心机(离心速度2 000 rrain)，稳压稳流电泳仪和水平电泳槽，电泳凝胶成像系统(或紫外分析仪)，混匀器，冰箱(28和一20两种)，微量可调移液器(10 pL、100 pL、1 000 pL)及配
19、套无RNA酶污染带滤芯吸头，Eppendorf管。92试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，一级水、二级水符合GBT 6682规定的要求；本标准所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。a)PBS：见A11；b)裂解液：Trireagent或其他等效裂解液；c)三氯甲烷；d)异丙醇：一20预冷；e)75乙醇：见B92；f)DEPC水：见B91；g) MMLV反转录酶：10 UpL；h)5RT缓冲液；i)RNA酶抑制剂：40 UpL；j)Taq酶：10 UL；k)loPCR缓冲液(M92+u11)；1)dNTPs：含有dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10
20、 mmolL；m)甘油或矿物油；n)引物：检测PRRSV的引物对，参见附录C，加DEPC水配制成100 ttmolL的储存液和20 pmolL工作液o)电泳缓冲液：05TBE缓冲液，见第11章；p) 电泳加样缓冲液：见第B 13章。93采样931器械下列采样工具应经(121土2)，15 min高压灭菌并烘干：5GUT 1 8090-2008棉拭子、剪刀、镊子、15 mL Eppendorf管、研钵。932样品肺、扁桃体、淋巴结和脾等组织样品；新鲜精液或冷冻精液；血清、血浆、全血或细胞培养物。94样品制备941组织取待检样品20 g在研钵中充分研磨，加PBS混匀，冻融两次，4，以3 000 rr
21、ain离心15 rain，取上清液备用。942精液冻融两次或超声波裂解，以10 000 rrain离心10 min，取上清备用。95操作方法951样品总RNA的提取9511取n个灭菌的15mL Eppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，编号。每管加人600 pL细胞裂解液，分别加入被检样品、阴性对照、阳性对照各200 pL，每加一份样品换用一个吸头，再各加入200 pL三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5 S。于4、以12 000 rmin离心15 min。95，12取与9511相同数量灭菌的15 mL Eppendor管，加入500 pL异丙醇(一20预冷)，做标记。吸取95
22、，11各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500 pL(不能吸出中间层)，颠倒混匀。9513于4、以12 000 rmin离心15 mln(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾千)；加入600 pL 75乙醇，颠倒洗涤。9514于4、以12 000 rrain离心10 min(Eppendorf管开El保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾于液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾于)。9515以4 000 rmin离心10 s(gppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)
23、，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀面，室温干燥3 min，不能过于干燥，以免RNA不溶。9516加人11 pL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以2 000 rmin离心5 s，冰上保存备用。提取的RNA应在2 h内进行PCR扩增；若需长期保存应放置于70冰箱内。952 RT-PCR操作程序9521反转录反应液总量20 pL。依次在RT反应管中加入以下反应物：a)模板：提取样品的总RNA 5 pL；b)下游引物P2：1 pL；c) 5RT缓冲液：4肚L；d) 10 mmolL dNTP；2“L；e)RNA酶抑制
24、剂：1 pL；f)MMLV反转录酶：1 p-L；g)DEPC水：6 pL。以4 000 rmin离心20 s，放人PCR仪中，RT条件：42、60 min，95、5 min。9522 PCR扩增PCR反应体系见表1。6表1检测PRRSV基因的PCR反应体系GBT 18090-200850 pL反应体系次 序 组分“L1 反转录产物 10o2 10PCR缓冲液 503 10 mmolL dNTPs 104 10氯化镁(25 retoolL) 3O5 上游引物P1(20 pmolL) 106 下游gl物P2(20 PmolL) 107 Taq酶(s U卢L) 058 加DEPC水至 50注：反应体
25、系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当的调整；没有热盖的PCR仪器需加人矿物油40 pL。9523 PCR反应条件设置各种试剂充分混合均匀后，以4 000 rrain离心30 s，放人PCR仪中，设定PCR程序。反应条件为95、5 rain，95、1 rain，5l、1 min，72、1 raia，35个循环；72、10 rain。试验检测结束后，根据琼脂糖凝胶电泳来判断试验结果。96结果分析和判定961 1琼脂糖凝胶的制备称取l g琼脂糖，加入到100 mL 05TBE缓冲液中。加热融化后稍冷却到40左右加5 p-L(10 mgmL)溴化乙锭，混匀后倒人放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5
26、mm左右。依据样品数量选用合适型号的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中已形成加样孔)，放入水平电泳槽中，加1TBE缓冲液淹没胶面。96，2加样取8 FL10 pL PCR扩增产物和2 p-L加样缓冲液混匀后加人一个加样孔。每次电泳应加阳性对照和阴性对照的扩增产物。并且设立DNA标准分子质量Marker作分子质量大小对照。963电泳条件电压80 V100 V，或电流40 mA50 raA，电泳时间30 min40 rain。964结果观察和判定a) 在紫外灯下观察核酸条带并判断结果；b)PCR后阳性对照孔会出现一条372 bp的DNA片段，阴性对照和空白对照没有核酸条带；c) 待测样品电泳后在
27、相应372 bp DNA位置上有条带者为PRRSv核酸检测结果阳性；d)无条带或条带的大小不是372 bp的为PRRSV核酸检测结果阴性。必要时，可取PCR扩增产物进行序列测定，序列结果与已公开发表的PRRSV特异性片段序列(参见附录c)进行比对，序列同源性在95以上，可判定待测样品PRRSV核酸检测结果阳性。10综台判定PRRS的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊应依靠实验室检查。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定，RT-PCR适用于该病病原的快速诊断。血清学方法主要用于检测PRRSV抗体。IPMA、IFA和间接ELISA群体水平上进行血清学诊断较易
28、操作、特异性强、敏感性高，但是对个体检测比较困难，有时出现非特异性反应，但是在2周4周后采血检测能够解决此问题。7GBT 18090-2008当在临床上怀疑有PRRSV感染时，可根据实际情况，由上述几种方法中选用一种或两种方法进行确诊，对于未接种过PRRS疫苗，经任何一种方法检测呈现阳性结果时，都可最终判定为PRRSV感染猪。对接种过PRRS灭活疫苗并在疫苗免疫期内的猪或已超越疫苗免疫期的猪，当病毒分离鉴定试验为阳性结果时，可终判为PRRSV感染猪；当仅血清学试验呈阳性结果时，应结合病史和疫苗接种史进行综合判定，不可一律视为PRRSV感染猪。A1试剂GBT 1 8090-2008附录A(规范性
29、附录)猪肺泡巨噬细胞(PAM)制备、鉴定、保存以及IPMA、IFA诊断板的制备A11磷酸盐缓冲盐水(PBS)a)原液甲氯化钠(NaCI)800 g氯化钾(Kcl)020 g磷酸氢二钠(NazHP04) 115 g磷酸二氢钾(KHzPOt) o20 g溶于500 mL一级水中，再加人5 mL 04酚红液，加一级水至800 mL，56 kPa、20 rain灭菌备用。b)原液乙氯化镁(MgClz6HzO) o1 g一级水加至 100 mI。56 kPa、20 rain灭菌备用。c)原液丙氯化钙(CaCl：) 01 g溶于100 mL一级水中，56 kPa、20 min灭菌备用。d)工作液原液甲8份
30、原液乙 1份原液丙 l份充分混合后备用。必要时，可适量加入抗生素(青霉素103 IUmL、链霉素103-gmL、庆大霉素103tgmL)，不加制霉菌素。A12细胞生长液a)含10犊牛血清的RPMll640液(含青霉素100 IUmL、链霉素100 pgmL、庆大霉素50 btgmL)；b) 含10犊牛血清的MEM液(含青霉素100 IUmL、链霉素100tgmL、庆大霉素50 btgmL)。A13细胞冻存液取细胞生长液80 mL，加入分析纯二甲基亚砜(DMSO)20 mL，混合均匀，不加制霉菌素。A2 PAM的制备取6周龄8周龄的SPF猪或被证实无PRRSV感染的健康猪，动脉放血致死后，立即无
31、菌操作取出肺，切勿划破被膜。每次用约200 mL PBS从气管灌入肺，挤压灌洗3次4次，收集灌洗液，以1 000 rrain离心10 rain，弃上清液，沉淀物用50 mL PBS再悬浮和离心洗涤2次3次。最后的细胞泥用50 mL细胞生长液悬浮，进行细胞计数，用细胞生长液稀释使细胞浓度达4107个15 mL。所得新鲜巨噬细胞立即使用或定量分装后冻存。9GBT 18090-2008A3 PAM的冻存取细胞浓度为6107个15 mL的细胞悬液，加入等量细胞冻存液，缓慢滴加，边加边振摇。用细胞冻存管分装，每管15 mL，放一70过夜，转入液氮中保存。液氮保存各批巨噬细胞，不可混合。A4 PAM的批次
32、试验每批巨噬细胞应检验合格后再使用。方法是：在96孔细胞培养板上用已知滴度的标准病毒感染巨噬细胞，并用标准的阳性血清和阴性血清进行IPMA或IFA测定。只有能支持特定滴度(TCIDs。)的标准病毒良好生长的巨噬细胞，方可用于试验。A5 PAM的复苏从液氮中取出冷冻细胞管，立即投入温水(37左右)中迅速解冻。将细胞移人10倍量的RPMll640液(pH72)中，以1 000 rrain离心10 rain，弃去上清液，沉淀的细胞用细胞生长液悬浮，计数，稀释至要求的细胞浓度后，即可使用。A6 IPMA诊断板的制备a)将长满单层的PAM细胞用消化液消化后，用RPMI 1640细胞生长液悬浮细胞，使细胞
33、浓度达105个细胞每100 gL，在96孔细胞培养板中每孔分别加入100 pL，将细胞培养板放人37、5二氧化碳培养箱中，培养18 h24 h；b)用细胞营养液稀释PRRSV为105 TCIDs。mL，每孔50 pL，剩余2孔不加PRRSV作为对照孔。放人37、5二氧化碳培养箱中，培养18 h24 h；c)弃去培养液，用生理盐水洗涤细胞培养板，弃去液体，在吸水纸上轻轻拍干，37干燥45 rain，密封后储存于-20备用。加入冷的4Vo多聚甲醛PBS，室温固定10 rain。或用冰冷的无水乙醇4固定45 rain，或冰冷的80丙酮固定45 rain。弃去一k述固定液，用生理盐水洗涤一次。A7 I
34、FA诊断板的制备96孔IFA诊断板：在96孔细胞培养板的2、4、6、8、10、12列分别加入50 pL无血清的MEM细胞培养基；用细胞分散液消化MARC一145，用含8FBS的MEM液稀释成每毫升10。个，加入到上述96孔细胞培养板中，每孔150 pL；37、5二氧化碳培养箱中培养至单层细胞备用；无血清的MEM培养基稀释PRRS标准毒，终浓度为105 TCID。mL，分别加到上述96孔细胞培养板的1、3、5、7、9、11列各孔内，每孔50“L。置37、5二氧化碳培养箱中培养48 h-72 h。弃去培养液，用PBS洗一次细胞，弃去PBS后，每孔加人丙酮150 pL，置4作用30mln，弃去丙酮，
35、室温干燥，密封于塑料袋内，一70冰箱中备用。8孔IFA诊断板：细胞分散液消化MARC一145，用含8FBS的MEM液稀释成每毫升105个，在8孔细胞培养板各孔中分别加入500 pL细胞悬液，置37、5二氧化碳培养箱中培养至单层；用不含血清的MEM培养基稀释PRRS标准毒，终浓度为105 TCIDsomL，取50 pL分别加到上述8孔细胞培养板中。置37、5二氧化碳培养箱中培养18 h。弃去培养液，用PBS洗一次细胞，弃去PBS后，每孔加入丙酮150 pL，室温固定10 min15 rain，弃去丙酮，室温干燥。密封，一70冰箱中保存。附录B(规范性附录)试剂的配制B1 PBS液(001 mol
36、L PBS，pll72)(用于IFA)氯化钠(Nacl)氯化钾(KCl)碳酸氢钠(NaHCO。)磷酸二氢钾(KHzPO。)二级水加至保存于4 oC备用。8 g02 g115 gO2 gl 000 mLB2洗涤液(001 molL PBS一005吐温一20，pH74)(用于间接ELISA)磷酸二氢钾(KHzPO。)磷酸氢二钠(Na。HPO。-12H。O)氯化钠(NaCl)氯化钾(KCl)吐温20二级水加至现用现配。02 g29 g80 g02 g05mL1 000 mLB3抗原稀释液(005 molL碳酸盐缓冲液，pH96)(用于间接ELISA)碳酸钠(Na。CO。)碳酸氢钠(NaHCO。)二级
37、水加至4保存，一周内用完。B4血清稀释液(用于IPMA和ELISA)159 g293 g1 000 mLGBT 1 8090-2008B41称取2922 g NaCl置于100 mL瓶中，加入约80 mL的二级水，高温高压灭菌后冷却至室温，加入4 mL马血清，500 pL吐温一80，用灭菌水补到100 mL，调节pH值至72，4保存。用于IPMA。B42含1犊牛血清白蛋白或10马血清的“A1”液。用于间接ELISA。B5封闭液(用于间接ELISA)含1犊牛血清白蛋白或10马血清的“A1”液。B6 显色底物溶液(用于IPMA)B61 AEC贮存液称取4 mg氨乙基咔唑(3一amino一9一eth
38、ylcarbazole，AEC)溶于4 mL二甲基甲酰胺(N，Ndimethy-formamide)中，充分溶解后置4避光保存。B62 005 molL pH 50乙酸钠缓冲液乙酸钠(CH。c00Na) 415 g11GBT 18090-2008二级水加至用冰乙酸调整至pH 50。B63乙酸盐缓冲液冰乙酸(cHaC00H)乙酸钠溶液二级水用冰乙酸调整至pH 50。B64显色底物溶液(AEC-H202)乙酸盐缓冲液AEC贮存液30过氧化氢(H：O。)充分混合后，用5,um滤纸过滤，现用现配。B7底物溶液(用于间接ELISA)B71 01 molL柠檬酸溶液柠檬酸(C。H。O，)二级水加至B72
39、01 molL磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠(Na。HPO。12H。O)二级水加至B73底物溶液(TMB-H：O：)01 molL柠檬酸溶液o1 molL磷酸氢二钠溶液四甲基联苯胺(TMB)30过氧化氢(H。O。)充分混合后装于褐色玻璃瓶避光存放。B8终止液(用于间接ELISA)1 molL氢氟酸(HF)溶液。148mL352 mL19 mL1 mL10“L192 g100mL358 g1。0 mL33OmL66OmL400mg15 mL现用现配。B9无RNA酶溶液的配制配制溶液所用的三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇等应采用未开封的新品，配置溶液所使用的一级水、容器、移液器吸嘴等应无RNA酶污染，操作过程
40、中应戴一次性的塑料或乳胶手套，避免人体的RNA酶污染。B91 DEPC水一级水 100mLDEPC 100“L1822室温下过夜，121、15 rain灭菌，或直接购买商品化的产品。B92 75乙醇DEPC水 25 mL无水乙醇 75 mL用无水乙醇和DEPC水配制，一20预冷。1 2GBT 18090-2008B10引物配制根据附录C的序列合成引物，加DEPC水配制成25lmolL。B。11 TBE电泳缓冲液(5x浓缩液)Tris 540 g硼酸 275 gEDTA 29 g一级水加至 1 000 mL用5 molL的盐酸(HCl)调到pH80，正式试验时用一级水稀释成工作浓度的05XTBE
41、缓冲液。B12 EB(核酸染色剂)用一级水配制成10 mgmL的浓缩液，用时每lO mL琼脂溶液中加1 pL。B13加样缓冲液每100 mL溶液中含：溴酚蓝025 g，蔗糖40 g。13GBT 1 8090-2008附录C(资料性附录)猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR方法引物序列、PRRSV特异性片段的序列C1猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR方法引物序列猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR方法的引物序列根据基因数据库(Genbank)中美洲株和欧洲株的病毒RNA中高度保守的开放阅读框ORF7(N基因)设计。引物的序列为：上游引物P1：5一GCGGATCCATGCCAAATAACAA(-3；下
42、游引物P2：5-AGCTcGAGTCATGCTGAGGGTGA一3。c2 PRRSV特异性片段的序列1 atgccaaata acaacggcaa gcagcaaaag aaaaagaagg ggaatggcca gcctgtcaat61 cagctgtgcc aaatgctggg taagatcatc gcecaacaaa accagtccag aggcaaggga121 ccggggaaga aaaataggaa gaaaaacccg gagaagcccc atttccctct agcgactgaa181 gatgacgtca ggcatcactt tacccctagt gagcggcaat tgtgtctgtc gtcgatccag241 actgccttca atcagggcgc tggaacttgt accctgtcag attcagggag gataagttac301 actgtggagt ttagtttgcc gacgcaacat actgtgcgtc tgatccgcgc cacagcatca361 ccctcagcat ga14
