1、ICS 65.020.20 B 31 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/ T 3775 2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT-LAMP 检测 方法 RT-LAMP method for Detectiong Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus 2020 - 04 - 08 发布 2020 - 05 - 15 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3775 2020 I 目 次 前 言 . 1 范围 .1 2 规范性引用文件 .1 3 缩略语 .1 4 原理 .1 5 试剂和仪器设备 .2 6 操作程序
2、.2 7 结果判定 .4 8 安全和防污染措施 .4 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 .5 附 录 B （资料性附录） .6 DB32/T 3775 2020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由南京农业大学提出 并归口 。 本标准起草单位：南京农业大学。 本标准主要起草 人：姜平、张日腾、白娟、熊富强、王先炜、李玉峰、陈闻。 DB32/T 3775 2020 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT-LAMP 检测方法 1 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT-LAMP检测 原理、试剂和仪器设备、检测程序和结果判 定。 本标准适用于猪临床样品
3、（肺脏、脾脏和血清）和细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测 ； 同时适用于 猪繁殖与呼吸综合征病毒 经典型、高致病 性 、类 NADC30型三 种基因亚型的 分型 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 3 缩略语 PRRSV: porcine repr
4、oductive and respiratory syndrome virus，猪繁殖与呼吸综合征病毒 LAMP： loop-mediated isothermal amplification, 环介导的恒温扩增 RT-LAMP： Reverse transcription, loop-mediated isothermal amplification，反转录环介导的恒温扩增。 4 原理 猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV）主要引起猪繁殖与呼吸综合征 (俗称蓝耳病 )。该病毒有美洲 型和欧洲型两个血清型。美洲型又有多个基因亚型。我国流行的美洲型 PRRSV 主要有传统型、高致病 性和类 NA
5、DC30 型毒株，其主要区别存在于病毒的 Nsp2 基因。环介导的恒温扩增（ LAMP）是一种体 外恒温核酸扩增技术，用于快速检测 DNA。 RT-LAMP 是一种逆转录 LAMP，用于检测 RNA。本标准 RT-LAMP，根据 PRRSV 开放阅读框架 7（ ORF7）基因序列、 ORF1a（非结构蛋白 Nsp2）基因序列设 计 4 组引物，建立 4 种 RT-LAMP 检测方法（即 LAMP1、 LAMP2、 LAMP3 和 LAMP4)，其中 LAMP1 的特异性引物识别 ORF7 基因， LAMP2、 LAMP3 和 LAMP4 的特异性引物识别 Nsp2 基因。每种 LAMP 引物均
6、包括两对内、外引物（内引物 FIP 与 BIP，外引物 F3 与 B3）和一对环引物（ LF 与 LB）。利用 Bst 酶启动循环链置换反应，启动 互补链合成，通过在同一链上互补序列周而复始形成有很多环状结构 的茎环 DNA 混合物，在恒温条件下完成核酸扩增反应。从 dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。 该检测方法简便快速、敏感特异，不需要昂贵的仪器设备。 DB32/T 3775 2020 2 5 试剂和仪器设备 5.1 试剂要求 除有特殊说明外，所有生化试剂均为分析纯。 RNA提取相关试剂或用
7、品 均 需经无 RNA酶处理。 5.2 引物 PRRSV LAMP检测引物和 PRRSV毒株基因亚型鉴别 LAMP引物，人工合成（基因序列见 附录 B.1） 。 5.3 通用试剂 裂解液（ TRIZOL）；氯仿； 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（ PBS， pH7.2）（见附录 A.1）； DEPC处理水（见 附录 A.2）；异丙醇； 75%乙醇；耐热 M-MLV（ RNase H-）反转录酶； pMD18-T载体；胶回收试剂盒（ Qiagen）； 质粒 DNA提取试剂盒（ TaKaRa）； PCR试剂（ Promega）。 5.4 LAMP 试剂 10Bst DNA 聚合酶缓冲液（见附录
8、A.3）； 100 mmol/L MgSO4； 10 mmol/L dNTPs （ dATP,dCTP ,dTTP,dGTP)； 8 U/L Bst DNA 聚合酶； 5 mol/L 甜菜碱（ Betaine）； 灭菌双蒸水。 SYBR Green I 染料， 1000。 5.5 阴性及阳性对照 5.5.1 阴性对照 pMD18-T空载体质粒。 5.5.2 阳性对照 LAMP1阳性对照为 pMD-BB-N质粒（含高致病性 PRRSV BB0907毒株 ORF7基因） ； LAMP2阳性对 照为 pMD-S1-Nsp2质粒（含传统型 PRRSV S1毒株 Nsp2基因） ； LAMP3阳性对照为
9、 pMD-BB-Nsp2质粒（含 高致病性 PRRSV BB0907毒株 Nsp2基因） ； LAMP4阳性对照为 pMD-FJ-Nsp2 质粒（含类 NADC30 PRRSV FJ1402毒株 Nsp2基因） 。 5.6 仪器 高速冷冻离心机，恒温水浴锅，微量移液器（ 0.5 L 10 L、 20 L 200 L、 100 L 1 000 L）， PCR 仪， EP 反应管（ 0.5 mL、 1.5 mL），组织匀浆器或研钵。 6 检测程序 6.1 样品处理 按照 NY/T 541动物疫病实验室检验采样方法，采集待检猪的肺脏、脾脏和血清等样品。肺脏、脾 脏取约 1g，剪碎后按 1:3（ V/
10、V）加入 PBS（ 0.01mol/L， pH7.2），充分匀浆呈悬液。血清制备方法为：血 DB32/T 3775 2020 3 液（不加抗凝剂）室温静置 2 h 3 h后， 4000 r/min离心 5 min，取上清液置于 EP管内。处理好的匀浆悬 液和血清于 -20 保存备用。 样品 RNA 制备按照经验证的 RNA 提取方法或等效的商品化 RNA 提取试剂盒，按照其使用说明操 作。提取的 RNA 应在 2 h 内进行反转录或放置于 -20 保存备用。 6.2 反转录（ cDNA 的合成） 配制反转录反应体系 19 L，含 M-MLV 5Reaction buffer（含 Mg2+） 4
11、 L； 2.5 mol/L dNTPs 1 L； Olige（ dT） 1L， RNA 酶抑制剂 0.5 L； DEPC ddH2O 5.5L, RNA 7 L， 70 水浴 5 min 后置冰上冷 却至 37 ，再加入 1.0 L 反转录酶 M-MLV， 42 水浴 1h 得 cDNA，用于下面 LAMP 扩增，或 -20 冻存备用。 6.3 LAMP 检测方法 6.3.1 反应体系 采用四管两步 RT-LAMP检测方法进行。 第一步（ 1管）：采用 LAMP1通用引物（见附录 B.1），检测所有 PRRSV 毒株。 第二步（ 3管）：对第一步检测结果为阳 性的样本，采用 LAMP2、 LA
12、MP3和 LAMP4引物（见附录 B.1）， 用 3个 EP管，同时进行 LAMP，鉴别不同基因亚型 PRRSV。 四个反应管反应体系相同，总体积 25 L， 具体反应体系如下： 但其中的引物不同，分别是 LAMP1、 LAMP2、 LAMP3和 LAMP4引物（见附录 B.1）。每次检测应分 别设立阴性和阳性对照样品管。 LAMP1阳性对照为 pMD-BB-N， LAMP2阳性对照为 pMD-S1-Nsp2， LAMP3阳性对照为 pMD-BB-Nsp2， LAMP4阳性对照为 pMD-FJ-Nsp2质粒 DNA，阴性对照为 pMD18-T空 载体质粒 DNA。 在 EP 管的管盖上滴加 1
13、000SYBR Green 染料 1.0 L， 再轻轻地把盖子盖紧。 6.3.2 反应条件 将反应管混匀，置 641 扩增 40 min 且保证管盖上的 SYBR Green I 不进入反应物。 10Bst DNA 聚合酶缓冲液（见附录 A.3） MgSO4（ 4mol/L） 2.5mM dNTPs 甜菜碱 （ Betaine） 外引物 F3/B3（ 4mol/L） 内引物 FIP/BIP（ 40mol/L） 环引物 LF/LB（ 10mol/L） Bst DNA 聚合酶 (8U) 耐热 M-MLV 反转录酶 cDNA 模板 双蒸水 2.5L 1.5L 3.5L 2.0L 各 1.0L 各 1
14、.0L 各 1.0L 1.0L 1.0L 1.5L 6.0L 总计 25L DB32/T 3775 2020 4 7 结果判定 7.1 PRRSV 阴阳性判定 反应结束后，将 LAMP1反应管 12 000 r/min，离心 1 min，轻轻混匀，观察颜色变化，绿色为阳性， 淡黄色为阴性。 7.2 PRRSV 基因亚型的类型判定 在阴性对照、阳性对照符合时，判定样品检测结果 （参见附录 B.2） 。 若 LAMP1 结果为阳性，则判定是 PRRSV 阳性 ，否则判定为 PRRSV 阴性。 若 LAMP2 检测为阳性， LAMP3、 LAMP4 检测为阴性，则判定是 PRRSV 经典型毒株。 若
15、 LAMP3 检测为阳性， LAMP2、 LAMP4 检测为阴性，则判定是 PRRSV 高致病 性 毒株。 若 LAMP4 检测为阳性， LAMP2、 LAMP3 检测为阴性，则判定是 PRRSV 类 NADC30 型毒株。 8 安全和防污染措施 8.1 检测废弃物等实验室安全防护按 GB 19489 和 SN/T 1193 的规定执行。 8.2 检测过程中防止污染措施按 GB/T 27401 的规定执行。 8.3 实验前后，实验室用紫外线消毒。 DB32/T 3775 2020 5 A A 附录 A （规范性附录） 试剂配制 A.1 0.01 mol/L（ pH7.2）的磷酸盐缓冲液（ PB
16、S） A 液（ 0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液）： NaH2PO42H2O 27.6 g，先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水 稀释至 1000 mL。 B 液（ 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液）： Na2HPO412H2O 71.6 g（或 Na2HPO4 2H2O 35.6 g）先用适量蒸 馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。 A 液 14 mL， B 液 36 mL，加氯化钠（ NaCl） 8.5 g，最后用蒸馏水定容至 1 000 mL； 121 ， 15 min 高压灭菌， 4 保存备用。 A.2 DEPC 处理水 用 0.1% DEPC 处理后的蒸馏水（ DEPC
17、 与蒸馏水 1:1000 混合），经 121 15 min 高压处理，用于溶 解 RNA。 A.3 10 Bst DNA 聚合酶缓冲液 含 200 mmol/L Tris-HCl， 100 mmol/L KCl， 100 mmol/L (NH4)2SO4， 20 mmol/L MgSO4， 1 % Triton-100， pH8.8， 25 保存。 DB32/T 3775 2020 6 B B 附 录 B （资料性附录） 引物序列 B1 PRRSV LAMP 检测引物和 PRRSV 毒株基因亚型鉴别 LAMP 引物序列，见表 B.1。 表 B.1 LAMP 引物序列 引物种类 引物名称 序列
18、bp 通用引物 LAMP1 G-F3 AGAAAAACCCGGAGAAGCC 140-156 G-B3 TGCTGAGGGTGATGCTGT 352-369 G-FIP ACAATTGCCGCTCACTAGGGGTTTTCCATTTCCCTCTTGCGACT 157-177 203-223 G-BIP CGCTGGAACTTGTGCCCTGTTTTTGCACAGTATGTTGCGTAGGC 258-277 318-337 G-LF GTGATGCCTGACGTCATCTTC 178-198 G-LB GGGAGGATAAGTTACACTGTGGA 286-308 BB-N F ATGCCAAT
19、AATAACGGCAAGCA 0-22 R TCATGCTGAGGGTGATGCTGT 351-371 经典毒株 LAMP2 C-F3 ACCGCAATGCATCTTCAGG 1523-1546 C-B3 GTCTGTGAGGAAGCAGACAA 1723-1743 C-FIP TCGGCTCACTCAAGGGTGTCATTTTAGTGAGCCGGCTCCAATT 1561-1578 1611-1619 C-BIP GCACCGCGGCGTAAGTTTCATTTTGTTCTGGTACGGTGGGATTG 1642-1662 1692-1711 C-LB GCAGGTGAAAAGATTGAGTT
20、CGGC 1664-1686 S1-Nsp2 F AGCTGGTGATTGTGTCCTCA 1500-1520 R CTCTACTCCCAGAACGCCCCC 1780-1800 高致病性毒 株 LAMP3 H-F3 TTGAGGCGGCGAATCAGA 887-905 H-B3 CCAGGACAACCTCTTCCAAC 1077-1096 H-FIP CCTTGCCCAAAGGCTCTTGAGTTTTTAACCGGACAACCTCACGT 906-923 955-976 H-BIP TGACCGCCTTCTCACTGTCCATTTTCCTCTCACGGTGATGAACCT 988-1008
21、1037-1054 H-LF CAGGGTGCAGCATGAGTTG 925-943 H-LB TGCTATTACCCTGCACAAGGTG 1012-1033 BB-Nsp2 F TTGAGGAATGCTTGGCCAA 800-818 R TCGACCTGCTCAGCCGCCCGGGCCA 1126-1250 类 NADC30 毒株 LAMP4 N-F3 TTGTGCTTCCTGGGGTTG 871-891 N-B3 AACTACCACACCTGGACCT 1384-1399 N-FIP GCCATGACAGAAACTGGAGCGTTTTTGAGGCTGCTCAAGCAACG 893-910
22、 934-957 N-BIP AAGCGGAGTCTGTCAGGAGCCTTTTGATCTTTCTGCGTGGGGC 1321-1343 1365-1384 N-LF TGGTTGATAGGGGGCAGTTC 912-927 N-LB TCCAGAGAGCAGGCCTCT 1343-1363 FJ-Nsp2 F TGAAGAATGCTTGGCTAGGCT 800-820 R CTACGCTTGACAGGGAGCT 1481-1500 DB32/T 3775 2020 7 B.2 RT-LAMP 结果示图 RT-LAMP检测结果示图 B.1 图 B.1 RT-LAMP检测方法染料染色图 1. 阳性样品（ +） 2. 阳性对照（ +） 3. 阴性对照（ -） _ _
