1、ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 34072019 猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA检测 方法 Indirect ELISA to detect antidody against porcine epidemic diarrhea virus 文稿版次选择 2019 - 11 - 04 发布 2019 - 12 - 04 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 34072019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标
2、准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽省动 物卫生监督所、霍邱县动物卫生监督所、广德县畜牧兽医水产局、合肥市动物疫病预防与控制中心、含 山县畜牧局、怀宁县平山镇农业站。 本标准主要起草人：潘孝成、洪功飞、沈学怀、李雪松、王扬龙、赵瑞宏、张丹俊、戴银、胡晓苗、 侯宏艳、周学利、陈曦、陈福军、钱昌银、胡业和、程志清。 DB34/T 34072019 1 猪流行性腹泻病毒 IgA 抗体间接 ELISA 检测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒 IgA 抗体的间接 ELISA 检测方法。 本标准适用于猪流行性腹泻病毒 IgA 抗体检测。 2 缩略语 下列
3、缩略语适用于本文件。 PEDV：猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus） ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzym e-Linked Immunosorbent Assay） HRP：辣根过氧化物酶（Horseradi sh Peroxidase） OD：光密度（Optical Density） IgA：免疫球蛋白A（Immun oglobulin A） 3 主要仪器 3.1 37培养箱。 3.2 酶联免疫检测仪。 3.3 酶联反应板 3.4 微量移液器（10 L、100 L、1000 L）和吸头。 3.5 多道移液器（10 L、100 L、300 L
4、） 3.6 台式低温高速离心机 4 试剂和材料 4.1 PEDV 纯化浓缩抗原 将第 30 代 PEDV-HX 株（TCID 50=10 7.35 /0.1 mL）接种 VERO 单层细胞，接毒后 72 小时收集病毒 培养物（含细胞和培养液），冻融 3 次，加入 1/10 体积的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，室温 振荡 10 min，6000 r/min 4高速离心 20 min，收集上清液；取上清液 45000 r/min 4超速离 心 120 min。弃去上清液，沉淀用 0.01 mol/L pH 为 7 .4 的 PBS 充分溶解（PBS 使用量按原来病毒培养物体 积的
5、1/20），即为 PEDV 纯化浓缩抗 原（测得蛋白浓度为 3.8 mg/mL）。 4.2 酶结合物 商品化的 HRP 标记的抗猪 IgA 抗体，工作浓度参照产品说明书。 4.3 标准阳性乳汁 PEDV 疫苗免疫健康猪制备，经琼扩法测抗体效价 1:64。 DB34/T 34072019 2 4.4 标准阴性乳汁 未免疫 PEDV 疫苗且未感染 PEDV 的健康猪乳汁，经琼扩检测为阴性。 4.5 包被液 称取碳酸钠 1.0 g 和碳酸氢钠 3.0 g 溶于 1000 mL 去离子水，调节 pH 值至 9.49.6。 4.6 磷酸盐缓冲液 称取十二水合磷酸氢二钠 0.25 g、二水合磷酸二氢钠 3
6、.5 g 和氯化钠 8.5 g，溶于 800 mL 去离 子水中，调节 pH 值至 7.27.6，用去离子水定容至 1000 mL。 4.7 封闭液 称取牛血清白蛋白 3.0 g，溶于 100 mL 磷酸盐缓冲液。 4.8 洗涤液 先配制 20 倍浓缩洗液， 称取十二水合磷酸氢二钠 5.0 g、 二水合磷酸二氢钠 70.0 g、 氯化钠 170.0 g、吐温-20 16.0 mL，加去离子水 800 mL，调节 pH 值至 7.47.6，用去离子水定容至 1000 mL，121 15 min 高压灭菌后，室温存放备用。使用前，将 20 倍浓缩液用蒸馏水或去离子水按 1:19 的比例混 合即可。
7、 4.9 稀释液 量取 5.0 mL 牛血清溶于 95.0 mL 磷酸盐缓冲液中。 4.10 底物液 A 称取 TMB 200.0 mg，无水乙醇（或二甲基亚砜）1 00 mL，加双蒸馏水至 1000 mL。 4.11 底物液 B 十二水合磷酸氢二钠 14.60 g、柠檬酸 9.33 g、0.7 5过氧化脲 6.4 mL，加三蒸馏水至 1000 mL， 调节 pH 值至 5.05.4。 4.12 终止液 将去离子水与浓盐酸（3638）以 9:1 的比例混合即可，室温保存。 4.13 商品化试剂盒 可选择同类商品化试剂盒。 5 样本的采集及处理 用 1.5 毫升的高压灭菌消毒离心管采集母猪产后
8、3 日内的初乳，样本量不少于 500 L，12000 rpm 离心 3 min，收集中间层的乳清，-20保存备用。 6 操作步骤 DB34/T 34072019 3 6.1 包被 用包被液将 PEDV 纯化浓缩抗原稀释至 2 g/mL，按 100 L/孔 加入酶联反应板中，28包被 16 小时。包被结束后，弃去孔中液体，每孔加入洗涤液 300 L，洗涤 1 次。 6.2 封闭 每孔加入新鲜配制的封闭液 300 L/孔，37封闭 3 小时。封闭结束后，弃去孔中液体，每孔加 入洗涤液 300 L，洗涤 1 次。 6.3 加检测样本 将待测检样本用稀释液作 1:10 稀释后，加入抗原包被板中，100
9、 L/孔，同时加入标准阴性、阳 性对照各两孔，100 L/孔，37反应 1 小时。弃去孔中液体，每孔加入洗涤液 300 L，洗涤 5 次， 吸水纸拍干。 6.4 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释至工作浓度，加入抗原包被板中，100 L/孔， 37反应 1 小时。弃去 孔中液体，每孔加入洗涤液 300 L，洗涤 5 次，吸水纸拍干。 6.5 显色 将底物液A 和底物液B 等体积混合，混合后立即加入抗原包被板中，每孔 100 L，37避光反应 10 分钟。 6.6 终止反应 每孔加入终止液 100 L。 6.7 读 OD 值 在酶联免疫检测仪 450 nm 波长处读取各孔 OD 数值。 7 结果判定 7.1 结果计算 P/N 计算，P/N=检测样品两孔平均 OD 450 值/阴性对照两孔平均 OD 450 值。 7.2 判定 7.2.1 阳性对照两孔平均 OD 450 值0.5，阴性对照两孔平均 OD 450 值0.2，判定实验条件成立。 7.2.2 当 P/N2.1，判为阳性，P/N2.1，则判为阴性。 7.2.3 使用商品化试剂盒时，按其说明书进行操作和判定。 _
