1、ICS 65.020.30 B 41 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 1019 2020 猪德尔塔冠状病毒 RT-PCR 检测方法 RT- PCR assay for detection of porcine deltacoronavirus 2020 - 12 - 28 发布 2021 - 02 - 01 实施 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 1019 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市畜牧兽医研究所。 本标准 主要 起草人：李秀丽、鄢明华、郑丽、路超、田
2、向学、张莉、李富强、江珊、任卫科、董志 民。 DB12/T 1019 2020 1 猪德尔塔冠状病毒 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪德尔塔冠状病毒（ porcine deltacoronavirus， PDCoV） RT-PCR检测方法的原理、 仪器设备与试剂、样品对照、方法步骤和结果判定等技术内容。 本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中 PDCoV核酸的检测。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（ porcine deltacoronavirus） PCR：聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction） RT-
3、PCR：反转录聚合酶链式反应（ reverse transcription-polymerase chain reaction） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid） cDNA：互补脱氧核糖核酸（ complementary DNA） PK-15细胞：猪肾细胞（ porcine kidney cell） DEPC：焦炭酸二乙酯（ diethylpyrocarbonate） Taq酶： Taq DNA聚合酶（ Taq DNA polymerase） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（ deoxy-ribonucl
4、eoside triphosphate） M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（ moloney murine leukemia virus） PBS：磷酸缓冲液（ phosphate buffer solution） TAE： Tris-乙酸电泳缓冲液（ tris acetate-EDTA buffer） 3 原理 PDCoV是一种 RNA病毒。 RNA反转录产生的 cDNA可作为 PCR模板进行扩增。根据 PDCoV M基因保守基因 序列设计一对引物，在 DNA聚合酶催化下，以母链 DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延 伸，体外复制出与母链模板 DNA互补的子链 DNA。依据 P
5、CR试验结果，判断样品中是否含有 PDCoV。 4 主要仪器设备 生物安全柜、组织研磨机、涡旋振荡器、台式低温高速离心机、 PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、 分析天平（精度 0.01g）、超低温冰箱（ -80）等。 5 试剂与引物 5.1 试剂 DB12/T 1019 2020 2 Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇、 M-MLV反转录酶、 RNA酶抑制剂、 DEPC处理的灭菌去离子水、 Taq DNA 聚合酶、 dNTP、 DL2000 DNA Marker、核酸染料、磷酸盐缓冲液（ PBS， 0.01 mol/L， pH 7.2）、 TAE电 泳缓冲液、琼脂糖。相关溶液配制方法见附录 A。
6、试剂均为分析纯。 5.2 引物 PDCoV M基因 PCR扩增方法所用引物见表 1： 表 1 PDCoV M 基因 PCR 扩增方法引物 引物名称 引物序列 引物浓度 扩增产物大小 上游引物 P1 5-ATTCTGCTTTGGCTGCTC-3 10 moL/L 359 bp 下游引物 P2 5-TCCTGTGGCGGATTTC-3 10 moL/L 6 样品对照 样品对照如下： 阳性对照样品： PDCoV 接种的 PK-15 细胞培养物； 阴性对照样品：正常 PK-15 细胞培养物。 7 方法步骤 7.1 样品的采集及处理 7.1.1 采样工具 1.5 mL离心管、剪刀、镊子和棉拭子，经 12
7、1（ 2）， 15 min高压灭菌， 50 60烘干备用。 7.1.2 采样方法 肠及肠内容物：选择空肠或回肠肠段，用绳子将肠两端扎紧，用剪刀采集 肠及肠内容物等，放入一 次性灭菌容器。 粪便：取发病猪新鲜粪便或者将棉拭子深入肛门转一圈蘸取粪便，将采集后的样本放入盛有 0.5 mL PBS溶液的 1.5 mL离心管中。 细胞培养物：将待检细胞培养物置 -20冰箱冰冻 12 h，解冻后震荡使细胞培养物脱离瓶壁，取 0.3 mL混合液放入 1.5 mL离心管中。 7.1.3 样品保存及运输 将采集的样品放入保温箱中，加入干冰，密封， 24 h内送至实验室。 7.1.4 样品处理 肠组织及肠内容物：
8、剪碎，用组织研磨机充分研磨，并按照质量体积比 1:5加入 PBS，冻融 3次，转 移至 1.5 mL离心管离心， 4， 4000 rpm/min， 10 min，取上清液 -80保存备用。 粪便：将含样品的离心管在涡旋振荡器上充分混合，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，弃去 拭子，进行离心， 4， 4000 rpm/min， 10 min，取上清液 -80保存备用。 细胞培养物：冻融 3次，转入 1.5 mL离心管中， 4000 rpm/min， 10 min，取上清液 -80保存备用。 DB12/T 1019 2020 3 7.2 RNA 提取 7.2.1 用 Trizol 提取待测样品、
9、阳性对照和阴性对照样品的 RNA。取 200 L 的样品和 800 L Trizol 置于一个 1.5 mL 离心管，反复颠倒混匀，室温静置 5 min。 7.2.2 向各管中加入 200 L 2 8预冷的氯仿，剧烈震荡 15 s，室温静置 5 min。 7.2.3 12000 rpm/min， 4 下离心 15 min，将每管中的上层含 RNA 的水相转移到一个新的 1.5 mL 离 心管中。 7.2.4 向管中加入等体积 2 8预冷的异丙醇，充分混合液体，室温静置 15 min。在 12000rpm/min 4 下离心 15 min，弃去上层的清液。 7.2.5 用 冰冷的 DEPC 处理
10、的 75%乙醇洗涤沉淀，温和震荡离心管， 12000 rpm/min， 4 离心 10 min， 吸去上层清液。 7.2.6 打开离心管管盖，在室温下放置 5 min 10 min，加入 50 L DEPC 水。 提取的 RNA 须在 2 h 内 进行 RT-PCR 扩增，若需长期保存，需置于 -80 的冰箱保存。 7.2.7 也可采用商品化的 RNA 提取试剂，按照说明书进行操作。同时进行阴阳对照样品 RNA 的提取。 7.3 反转录反应（ cDNA 的合成） 将上述步骤所得的病毒总 RNA进行反转录反应。反转录体系为： 5MLV 缓冲液 4 L， 氯化镁 2 L， dNTP 2 L，随机引
11、物 1 L， M-MLV反转录酶 0.5 L， Rnase抑制剂 0.5 L， RNA 10 L。反转录反应 条件为： 30 10 min， 42 1 h， 99 5 min。得到的 cDNA溶液直接用于下面的 PCR扩增或者 -20冻 存备用。 7.4 PCR 反应 将上述步骤得到的样品 cDNA进行 PCR反应。 PCR反应体系为： 10rTaq Buffer 2 L， 氯化镁 1 L， dNTP 2 L， 上游引物 P1 1 L， 下游引物 P2 1 L， cDNA 4 L， rTaq 0.5 L，加入 灭菌双蒸水定容 至 最终总体积 20 L。充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。
12、PCR反应条件为： 94 5 min； 94 30 s， 60 30 s， 72 30 s， 30 cycles； 72 7 min。 7.5 电泳及观察 将 PCR扩增产物 8 L与 2 L上样缓冲液混合，点样于 1琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝胶板一 侧点样孔加入 DL2000 DNA Marker（分子质量标准物），电泳缓冲液为 1 TAE，电泳条件为 100 V， 20 min 左右。将电泳产物取出，置于凝胶成像系统下观察并拍照，以分子质 量标准为参照判断扩增产物大小。 8 结果判定 8.1 质控标准 当阳性对照出现 359 bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带，阴性、阳性同时成立表明
13、实验结果有 效，否则实验无效。 8.2 结果判定 结果判定如下： 阴性 ： 被检样品未出现 359 bp 扩增条带，判为 PDCoV 核酸阴性，如图 1 所示 ； 阳性 ： 被检样品出现 359 bp 扩增条带，判为 PDCoV 核酸阳性，如图 1 所示。 DB12/T 1019 2020 4 注： M： DNA分子质量标准； 1：阴性对照样品； 2：阳性对照样品 图 1 PDCoV RT-PCR 产物电泳结果 DB12/T 1019 2020 5 A A 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 PBS缓冲液 A.1.1 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠 71.6 g，加
14、适量灭菌去离子水溶解，定容至 1000 mL，混匀。 A.1.2 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠 27.6 g，加适量灭菌去离子水溶解，定容至 1000 mL，混匀。 A.1.3 量取 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液 36 mL， 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液 14 mL，称取氯化钠 8.5 g， 用灭菌去离子水溶解稀释至 1000 mL， 4 保存。 A.2 50 TAE电泳缓冲液 A.2.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠（ EDTA）溶液（ pH 8.0） 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 2%氢氧化钠溶液 调 pH至 8.0 灭
15、菌双蒸水 加至 100 mL A.2.2 TAE电泳缓冲液（ 50） 羟基甲基氨基甲烷（ Tris） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液 (pH 8 .0) 100 mL 灭菌双蒸水 加至 1000 mL A.3 1琼脂糖凝胶 琼脂糖（电泳级） 1 g 1TAE 电泳缓冲液 100 mL 微波炉中完全融化，降温至 60 左右，加核酸染料 5 L，均匀铺板。 A.4 DEPC水 取 DEPC 100 L，加灭 菌去离子水至 100 mL，室温放置 6-8 h， 121（ 2） ， 15 min高压灭菌，分 装到 1.5 mL DEPC处理过的离心管。 _
