1、ICS 13.060 Z 16 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3632 2019 渔业用水中多西环素、四环素、土霉素、金 霉素残留量的测定 高效液相色谱法 Determination of doxycycline, tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline， residues in fishery water by high performance liquid chromatography (HPLC) 2019 - 07 - 23发布 2019 - 08 - 23实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 36
2、32 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 原理 . 1 4 试剂与配制 . 1 5 仪器和设备 . 2 6 试样的测定 . 2 6.1 样品的制备 . 2 6.2 样品的提取净化 . 2 6.3 标准曲线的制备 . 2 6.4 测定 . 2 7 计算 . 3 8 检测限 . 3 9 回收率 . 3 10 精密度 . 4 附 录 A （资料性附录） 色谱图 . 5 DB37/T 3632 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文 件的发布机构不承担识别这些专利的责任
3、。 本标准由山东省 农业农村厅 提出并监督实施。 本标准由山东省渔业标准化技术委员会 (鲁 TC 03)归口 。 本标准起草单位：济宁市渔业监测站。 本标准主要起草 人：史艳伟、孟 丽华、时 彦民、刘方、吴广州、蒋帮铜、孟娟、邓晨曦、简康、时 兵。 DB37/T 3632 2019 1 渔业用水中多西环素、四环素、土霉素、金霉素残留量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了渔业用水中土霉素 (Oxytetracycline)、四环素（ Tetracycline）、金霉素 (Chlortetracycline)、多西环素（ Doxycycline， Vibramycin又名强力霉素、脱氧土
4、霉素）残留量的测 定原理、试剂与配制、仪器和设备、试样的测定、计算、检测限、回收率与精密度等。 本标准适用于渔业用水中土霉素、四环素、 金霉素、多西环素残留量 的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 水样经 HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱仪配紫外检测器测定，外标法定量。 4 试剂与配制 所用试剂除另有规定外，均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682一级水标准。 4.1 甲醇：
5、色谱纯。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 磷酸：色谱纯。 4.4 磷酸二氢钠。 4.5 0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷 酸二氢钠 1.56 g，用 950 mL水溶解，磷酸调 pH至 2.5，用 水稀释并定容至 1 000 mL，过 0.45 m水相滤膜备用。 4.6 土霉素标准品：（ CAS： 2058-46-0）纯度 96.0 %。 4.7 四环素标准品：（ CAS： 64-75-5）纯度 94.0 %。 4.8 金霉素标准品：（ CAS： 64-72-2）纯度 99.0 %。 4.9 多西环素标准品：（ CAS： 24390-14-5）纯度 98.0 %。 4.10 土霉素、
6、四环素、金霉素、多西环素标准储备液：分别准确称取土霉素标准品 0.010 0 g，四环 素标准品 0.010 0 g，多 西环素标准品 0.010 0 g，金霉素标准品 0.020 0 g，用甲醇溶解并定容至 100 mL，制得土霉素、四环素、多西环素浓度分别为 100 g/mL，金霉素浓度为 200 g/mL的标准储备液， -18 避光保存，有效期 6个月。 DB37/T 3632 2019 2 4.11 土霉素、四环素、金霉素、多西环素混合标准使用液：分别移取 4.10中的标准储备液 10.0 mL， 定容至 100 mL，制得土霉素、四环素、多西环素浓度为 10 g/mL，金霉素浓度为
7、20 g/mL的混合标 准使用液， 0 4 避光保存，有效期 2周。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱仪，配紫 外检测器。 5.2 氮吹仪。 5.3 超声波清洗器。 5.4 超纯水仪。 5.5 涡旋混合器。 5.6 分析天平：感量 0.000 1 g。 5.7 HLB固相萃取柱： 60 mg， 3 mL，或性能相当者。 5.8 抽滤装置。 6 试样的测定 6.1 样品的制备 水样经 0.45 m滤膜过滤，备用。 6.2 样品的提取净化 固相萃取小柱预先用 3 mL甲醇、 3 mL水活化，准确量取 60 mL经过滤后的水样（ 6.1），转移至固相 萃取柱中，控制流速不超过 2 mL/min， 用
8、 5 mL水淋洗小柱，抽干，用 8 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于 10 mL 具塞玻璃离心管中，于 40 下氮气吹干，残留物用 1.0 mL流动相溶解定容，涡旋混合 1 min，超声 2 min， 过 0.45 m滤膜，供液相色谱测定。 6.3 标准曲线的制备 分别准确移取 0.5 mL、 1.0 mL、 2.0 mL、 5.0 mL、 10.0 mL混合标准使用液（ 4.11），用流动相定 容至 100 mL，制得一系列浓度的混合标准工作液，使其中土霉素、四环素、多西环素浓度系列为 0.05、 0.10、 0.20、 0.50、 1.0 g/mL；金霉 素标准使用浓度系列为 0.10、 0.2
9、0、 0.50、 1.0、 2.0 g/mL。 此标准使用液现配现用。以峰面积为纵坐标，对应 的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。 6.4 测定 6.4.1 色谱参考条件 6.4.1.1 色谱柱： XDB-C18柱， 250 mm 4.6 mm（ i.d.）， 5 m；或者性能相当者。 6.4.1.2 流动相： A：乙腈； B： 0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液（ 4.5）。 6.4.1.3 流速： 1.0 mL/min。 6.4.1.4 进样量： 50 L。 6.4.1.5 波长： 350 nm。 6.4.1.6 柱温： 30 。 6.4.1.7 流动相梯度洗脱程序见表 1。 DB37/T
10、3632 2019 3 表 1 流动相梯度洗脱程序 时间（ min） A（ %） B（ %） 0 17.0 83.0 15 32.0 68.0 16 45.0 55.0 17 45.0 55.0 18 17.0 83.0 25 17.0 83.0 6.4.2 液相色谱测定 在上述色谱条件下对标准工作液和样品溶液分别进行测定，土霉素、四环素、金霉素、多西环素保 留时间分别为 6.2 min、 7.5 min、 12.1 min、 13.5 min。标准工作液和样品溶液中土霉素、四环素、金 霉素、多西环素响应值均应在仪器检测线性范围内。液相色谱图参见附录 A（图 A.1、图 A.2）。 6.4.3
11、 空白试验 除不加试样外，均 按上述测定条件和步骤进行。液相色谱图参见附录 A（图 A.3）。 7 计算 试样中土霉素、四环素、金霉素、多西环素残留量按公式计算 。计算结果需扣除空白值，结果保留 3位有效数字。 0V VCX . (1) 式中： X 样品中各抗生素含量，单位为毫克每升（ mg/L）； C 样品溶液中各抗生素含量，单位为微克每毫升（ g/mL）； V 样品溶液最终定容体积，单位为毫升（ mL）； V0 样品溶液量取体积，单位为毫升（ mL）。 8 检 测限 本方法土霉素、四环素、多西环素检出限为 5 g/L、定量限为 10 g/L；金霉素检出限为 10 g/L、 定量限为 20
12、g/L。 9 回收率 土霉素、四环素、多西环素在添加浓度 10 g/L 50 g/L时，回收率均为 70 % 110 %；金霉素 在添加浓度 20 g/L 100 g/L时，回收率均为 70 % 110 %。 DB37/T 3632 2019 4 10 精密度 本方法的批内相对标准偏差小于 15 %，批间相对标准偏差小于 15 %。 DB37/T 3632 2019 5 A A 附 录 A （资料性附录） 色谱图 标准溶液色谱图见图 A.1，水样加标样品色谱图见图 A.2，空白水样色谱图 见图 A.3。 说明： 土霉素 浓度为 0.5 g/mL。 四环素 浓度为 0.5 g/mL。 多西环素 浓度为 0.5 g/mL。 金霉素 浓度为 1.0 g/mL。 图 A.1 标准溶液色谱图 DB37/T 3632 2019 6 说明： 土霉素 添加量为 0.01 g/mL。 四环素 添加量为 0.01 g/mL。 多西环素 添加量为 0.01 g/mL。 金霉素 添加量为 0.02 g/mL。 图 A.2 水样加标样品色谱图 图 A.3 空白水样色谱图 _
