1、ICS 11.120.10 C 12 DB13 河北省 地方标准 DB 13/T 5221 2020 土壤中 土霉素、金霉素、四环素、多西 环素、美他霉素的测定 高效液相色谱 -串联 质谱法 2020 - 09 - 18 发布 2020 - 10 - 18 实施 河北省市场监督管理局 发布 DB13/T 5221 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准 由河北省市场监督管理局提出。 本标准起草单位：河北省环保产品质量监督检验院、张家口翼华环境检测技术有限责任公司、河 北德普环境检测有限公司。 本标准主要起草人：吕晓飞、蔡立鹏、耿晓红、陈静、刘肖肖、
2、何淑娟、张玉、刘娜、孙鹏、王 玲、米卫军、王天星。 DB13/T 5221 2020 1 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定高效 液相色谱 -串联质谱法 1 范围 本标准规定了土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素 、美他霉素的高效液相色谱 -串联质谱测 定方法。 本标准适用于土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的测定。 按称样量 5 g， 50 mL提取液中移取 10 mL净化，净化液浓缩、定容至 1.0 mL，进样量 1 L分析， 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他霉素的检出限为 2.5 g/kg，测定下限为 10 g/kg。 2 规范性引用文件
3、下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 HJ/T 166 土壤环境监测技术规范 HJ 613 土壤干物质和水分的测定重量法 3 原理 土壤中四环素类抗生素用 Na2EDTA-Mellvaine缓冲液（ pH=4.0） +乙腈（ 7+3）提取，经过滤和离心 后，上清液用 HLB固相萃取柱净化。净化液中的四环素类抗生素经高效液相色谱分离，电喷雾离子源离 子化，通过保留时间和特征离子对丰度比定性，峰面积外标法定量。 4 干扰和消除
4、四环素类抗生素均属于高极性弱酸弱碱化合物，易与土壤中的金属离子、蛋白质结合，影响提取。 通过 Na2EDTA-Mellvaine缓冲液可有效防止金属离子与四环素类抗生素螯合。提取液中加入乙腈，并在 低温下离心，可有效去除蛋白质的干扰。提取液经 HLB固相萃取柱净化，可进一步去除干扰物质并有效 降低基质对质谱的干扰效应。 5 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682规定的一级水。 5.1 甲醇：色谱纯。 5.2 乙腈：色谱纯。 5.3 乙酸乙酯：色谱纯。 5.4 甲酸：色谱纯。 DB13/T 5221 2020 2 5.5 乙二胺四乙酸二钠（ Na2EDTA H2O
5、）。 5.6 柠檬酸（ C6H8O7 H2O）。 5.7 磷酸氢二钠（ Na2HPO4 12H2O）。 5.8 柠檬酸溶液（ 0.1 mol/L）：称取 21.01 g 柠檬酸（ 5.6），用水溶解，定容至 1 000 mL。 5.9 磷酸氢二钠溶液（ 0.2 mol/L）：称取 28.41 g 磷酸氢二钠（ 5.7），用水溶解，定容至 1 000 mL。 5.10 Mellvaine 缓冲溶液：将 1 000 mL 0.1 mol/L 柠檬酸溶液（ 5.8）与 625 mL 0.2 mol/L 磷酸氢 二钠溶液（ 5.9）混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节 pH=4.0。 5.11 Na2ED
6、TA-Mellvaine 缓冲溶液（ 0.1 mol/L）：称取 60.5 g 乙二胺四乙酸二钠（ 5.5）放入 1 625 mL Mellvaine 缓冲溶液（ 5.10）中，使其溶解，摇匀。 5.12 Na2EDTA-Mellvaine 缓冲溶液 +乙腈（ 7+3）：量取 700 mL Na2EDTA-Mellvaine 缓冲溶液与 300 mL 乙腈混合。 5.13 甲醇 +水（ 1+19）：量取 5 mL 甲醇（ 5.1）与 95 mL 水混合。 5.14 甲醇 +乙酸乙酯（ 1+9）：量取 10 mL 甲醇（ 5.1）与 90 mL 乙酸乙酯（ 5.3）混合。 5.15 HLB 固相
7、萃取柱：二乙烯苯 /N-乙烯基吡咯烷酮复合填料萃取柱（ 60 mg， 3 mL），或其他性能 相 5.16 近的固相萃取小柱。使用前用 5 mL 甲醇、 5 mL 水活化处理，保持柱体湿润。 5.17 甲酸水溶液（ 0.1%）：准确量取 1.0 mL 甲酸（ 5.4）于 1 000 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至 刻度。 5.18 乙腈 +甲酸水溶液（ 2+8）：量取 20 mL 乙腈（ 5.2）与 80 mL 甲酸水溶液（ 5.16）混合。 5.19 标准物质：土霉素（ oxytetracycline， CAS： 6153-64-6）、金霉素（ chlortetracycline， CAS
8、： 57-62-5）、四环素（ tetracycline， CAS： 60-54-8）、多西环素（ doxycycline， CAS： 564-25-0）、 美他霉素（ methacycline， CAS： 914-00-1）。纯度均大于或等于 95%。 5.20 标准储备液（ 100 g/mL）：准确称取土霉素、金霉素、四环素、多西环素和美他霉素各 10.0 mg，分别用甲醇溶解并定容至 100 mL， 4贮存于密封棕色瓶中。 5.21 混合标准中间液（ 1 000ng/mL）：准确吸取各标准储备液（ 5.19） 1mL 于 100mL 容量瓶中，用 甲醇定容至刻度，摇匀， 4贮存于密封棕色
9、瓶中。 5.22 混合标准使用液：准确吸取混合标准中间液（ 5.20） 0.1、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0mL， 于 5 个 10mL 容量瓶中，用乙腈 +甲酸水溶液（ 5.17）定容，此标准系列中各抗生素的浓度分别为： 10、 50、 100、 200、 500 ng/mL。 6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱 -串联质谱仪：配电喷雾离子源（ ESI）。 6.2 电子天平：感量 0.01g 和 0.0001g。 6.3 快速混匀器。 6.4 离心机：转速不低于 5000r/min。 6.5 氮吹浓缩仪。 6.6 固相萃取真空装置。 6.7 pH 计：测量精度 0.02。 6.8
10、 超声提取器。 6.9 往复式振荡器（频率不低于 100 次 /min）。 6.10 一般实验室常用仪器和设备。 DB13/T 5221 2020 3 7 样品 7.1 样品采集和保存 土壤样品按照 HJ/T 166的相关要求进行采集和保存。 样品应于洁净的具塞磨口棕色玻璃瓶中保存。 运输过程中应密封、避光、 4 以下冷藏。运至实验室后，若不能及时分析，应于 4 以下冷藏、避 光、密封保存，保存时间不超过 10天。 7.2 样品的制备 将样品混匀，除去样品中的异物（枝棒、叶片、石子等），按照 HJ/T 166的要求，将采集的样品 在实验室中自然风干、破碎、过 60目筛，保存备用。如果土壤中水分
11、含量较高（大于 30%），应先进行 离心分离出水相，再进行干燥处理。 7.3 干物质的测定 土壤样品干物质含量按照 HJ 613测定。 7.4 试样的制备 7.4.1 提取 称取 5 g（精确至 0.0001g）土壤样品于 50 mL离心管中，加入 20 mL Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液 + 乙腈（ 7+3）（ 5.12） ，涡旋混匀 1min使其分散，然后 超声提取 30 min、 往复振荡 （ 100次 /min） 提取 30 min。取出离心管， 5000 r/min条件下离心 5 min，转移上清液 至 50 mL容量瓶中。再分别用 20 mL、 10 mL Na2ED
12、TA-Mellvaine缓冲溶液 +乙腈（ 7+3）（ 5.12）重复提取两次，合并上清液，定容至 50 mL， 用快速滤纸过滤，待净化。 7.4.2 净化 准确移 取 10.0 mL滤液 ， 以 0.5 mL/min速度通过 HLB固相 萃取柱 （ 5.15） ，然后依次用 5 mL水和 5 mL 甲醇 +水（ 5.13）淋洗，弃去淋洗液。 2.0 kPa以下减压抽干 5 min，用 10 mL甲醇 +乙酸乙酯（ 5.14）洗 脱。将洗脱液氮吹浓缩至干，用 1.0 mL乙腈 +甲酸水溶液（ 5.17）溶解残渣，过 0.22 m滤膜，待测定。 7.5 空白试样的制备 不称取样品， 按照与试样制
13、备（ 7.4）相同的步骤进行空白试样的制备。 8 分析步骤 8.1 色谱参考条件 a) 色谱柱： 联苯色谱柱（ 3.0 mm 50 mm， 2.6 m），或 相当者 ； b) 流动相：乙腈（ 5.2） +甲酸水溶液（ 5.16），梯度洗脱（梯度洗脱程序见表 1）； c) 流速： 0.5 mL/min； d) 柱温： 35 ； e) 进样量： 1 L。 DB13/T 5221 2020 4 表 1 梯度洗脱程序 时间 /min 乙腈 /% 甲酸水溶液 /% 0 20 80 3.5 30 70 3.6 60 40 4.5 60 40 4.6 20 80 5.5 20 80 8.2 质谱参考条件 离
14、子化模式：电喷雾电离正离子模式（ ESI+）；质谱扫描方式：多反应监测（ MRM）；其他参考质 谱条件见附录 A。 8.3 定性测定 待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在 0.5%之内。每种化合物的质 谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，且同一检测批次，对同一化合物，样品 中目标物的两个离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表 2规定的范围。 表 2 定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50% 20% 50% 10% 20% 10% 允许的相对偏差 20% 25% 30% 50% 8.4 定量分析 在 8.1和 8.2仪器
15、条件下，对系列标准溶液（ 5.21）和试样溶液（ 7.4.2）进行分析。以标准样品中 四环素类抗生素的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做线性回归方程，计算出试样溶液中四环素类抗 生素的浓度。标准溶液的色谱图参见附录 B。 8.5 空白试验 按照与试样测定（ 8.1）相同的仪器条件进行空白试样（ 7.5）的测定。 9 结果计算与表示 土壤中土霉素、金霉素、四环素、多西环素和美他霉素的含量 X 按式（ 1）计算： (1) 式中： X 土壤中 各被测组分 的含量，单位为 微 克每千克（ g/kg）； Ci 试样溶液中 各被测组分 的浓度，单位为 纳克每毫升 （ ng/mL）； C0 空白 试样溶液中
16、各被测组分 的浓度，单位为 纳 克每 毫 升（ ng/mL）； DB13/T 5221 2020 5 V 试样最终定容体积，单位为毫升（ mL）； m 试样质量，单位为克（ g） ； wdm 土壤样品的干物质含量，单位为（ %）； f 稀释 因子。 计算结果保留三位有效数字，当计算结果 1000 g/kg时，可将结果折算成 mg/kg单位表示，保 留三位有效数字。 10 精密度和准确度 六家实验室分别对土霉素加标浓度为 2.26 g/kg、 11.3 g/kg和 56.5 g/kg的 土壤 统一样品进 行了 6次重复测定：实验室 间 相对标准偏差范围分别为 7.7% 19.6%、 1.9% 2
17、0%和 1.8% 10.4%；实验 室间 加标回收率范围 分别为 82.5% 94.6%、 88.7% 103.8%和 98.3% 111.5%。 六家实验室分别对 金 霉素加标浓度为 2.18 g/kg、 10.9 g/kg和 54.6 g/kg的 土壤 统一样品进 行了 6次重复测定：实验室 间 相对标准偏差范围分别为 6.1% 17.3%、 4.1% 14.7%和 1.4% 10.8%；实 验室间 加标回收率范围 分别为 80.7% 101.0%、 94.2% 108.8%和 94.2% 103.6%。 六家实验室分别对 四环素 加标浓度为 2.40 g/kg、 12.0 g/kg和 6
18、0.1 g/kg的 土壤 统一样品进 行了 6次重复测定：实验室 间 相对标准偏差范围分别为 7.5% 15.6%、 5.7% 21.2%和 3.0% 8.6%；实验 室间 加标回收率范围 分别为 83.8% 100.7%、 93.9% 112.3%和 99.8% 105.8%。 六家实验室分别对 多西环素 加标浓度为 2.22 g/kg、 11.1 g/kg和 55.5 g/kg的 土壤 统一样品 进行 了 6次重复测定：实验室 间 相对标准偏差范围分别为 7.5% 18.1%、 5.2% 23.5%和 2.6% 13.2%； 实验室间 加标回收率范围 差分别为 83.5% 93.2%、 8
19、4.4% 104.8和 97.4% 101.3%。 六家实验室分别对 美他霉素 加标浓度为 2.24 g/kg、 11.2 g/kg和 56.0 g/kg的 土壤 统一样品 进行了 6次重复测定：实验室 间 相对标准偏差范围分别为 6.7% 19.5%、 3.8% 17.7%和 3.5% 9.4%；实 验室间 加标回收率范围 分别为 86.1% 94.7%、 91.2% 103.3%和 90.2% 104.4%。 11 质量保证和质量控制 11.1 每批样品至少做 2 个空白 试样 ，空白值的测定结果应低于方法检出限。 11.2 每次分析应建立标准曲线，其相关系数应 0.999 。 11.3
20、每 20 个样品或每批次（少于 20 个样品 /批）分析结束后，需进行标准系列中间浓度点核查，其 测定值与标准值的相对误差应在 10% 以内。 11.4 每 20 个样品或每批次（少于 20 个样品 /批）应分析一个平行样，平行样测定结果相对偏差应 20% 。 11.5 每 20 个样品或每批次（少于 20 个样品 /批）应同时测定 1 个有证标准样品，其测定结果与保证 值的相对误差应在 15% 以 内；或每 20 个样品或每批次（少于 20 个样品 /批）应分析 1 个基体加标样 品，加标回收率应在 80% 120%之间。 12 废物处理 实验中产生的废物应分类收集，并做好相应标识，委托有资
21、质的单位进行处理。 13 注意事项 DB13/T 5221 2020 6 13.1 空白试样制备时的操作要与试样制备时的 操作 保持一致 。 13.2 试验所用的有机试剂有一定的毒性和挥发性，建议在通风橱进行操作 。 DB13/T 5221 2020 7 A A 附 录 A （资料性附录） 参考质谱条件 A.1 参考质谱条件： a) 气帘气（ CUR）： 20 psi； b) 离子化电压： 5500 V； c) 离子源加热温度： 600 ； d) 喷撞气（ CAD）： 8 mL/min； e) 喷雾气（ GS1）： 50 psi； f) 辅助加热气（ GS2）： 50 psi； g) 其他质谱
22、参数参见表 A.1。 表 A.1 四环素类抗生素的主要参考质谱参数 化合物 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 驻留时间 /ms 碰撞电压 CE/eV 去簇电压 DP/eV 土霉素 461.1 426.2a 50 26 80 443.1 50 20 80 金霉素 479.1 444.2 a 50 31 80 462.2 50 28 80 四环素 445.2 410.0 a 50 31 80 427.2 50 22 80 多 西霉素 445.2 428.2 a 50 25 80 154.2 100 38 80 美他霉素 443.2 381.2 100 24 80 426.2 a 50 33 80 注 ：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化的最佳。 a 定量离子。 DB13/T 5221 2020 8 B B 附 录 B （资料性附录） 多反应监测（ MRM）色谱图 DB13/T 5221 2020 9 说明： 1 四环素（ 1.52 min）； 2 土霉素（ 1.21 min）； 3 金霉素（ 2.64 min）； 4 美他霉素（ 2.68 min）； 5 多西环素（ 2.89 min）。 图 B.1 5种四环素类抗生素标准溶液的离子色谱图 _
