1、ICS 65.020 B 01 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3894 2020 大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技 术规程 Detection and identification of turnip mosaic virus and cucumber mosaic virus in Chinese cabbage 2020 - 03 - 31 发布 2020 - 05 - 01 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB 37/T 3894 2020 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东
2、省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：吴斌、辛相启、王升吉、姜珊珊、张眉、辛志梅。 DB 37/T 3894 2020 1 大白菜芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒检测技 术规程 1 范围 本标准规定了大白菜中芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒的间接 ELISA、 Dot-ELISA和普通 RT-PCR检测方 法。 本标准适用于山东省芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒在传播介体蚜虫和大白菜中的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改
3、单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 样品采集与保存 3.1 蚜虫样品采集 在蚜虫盛发初期进行蚜虫样品采集，于白菜田、周 边蔬菜田或田间杂草丛等蚜虫喜好栖息环境，采 用直径 33cm的 35目纱网在田间随机进行扫扑，分拣装入试剂瓶中， 100%乙醇浸泡， -20 以下冰箱保存 备用。 3.2 叶片样品采集 采集表现 TuMV和 CMV花叶、皱缩、植株矮化、畸形等典型症状的大白菜叶片 5g 10g，单株样品袋存 放。样品采集后，在冷藏条件下（ 2C 8C）运送至实验室。如果样品在 2天内检测，可暂时储存于 2C 8C冷藏箱；如果样品在 2天以后检测，
4、保存至 -80 超低温冰箱备用，样品避免反复冻融。 4 主要仪器设备、用具和试剂 4.1 仪器设备 仪器设备主要有： a) 酶标 仪 ； b) 洗板机 ； c) 电子天平（感量 0.001g） ； d) PCR仪 ； e) 电泳仪 ； f) 水平电泳槽 ； g) 凝胶成像仪 ； h) 高速冷冻离心机 ； i) 水浴锅 ； DB 37/T 3894 2020 2 j) 样品冷藏柜 ； k) 低温冰箱（ -20C） ； l) 超低温冰箱（ -80C） ； m) 磁力搅拌器 ； n) 高压灭菌锅 ； o) 可调微量移液器（ 10L、 100L、 200L、 1000L） 。 4.2 用具 用具主要有
5、： a) 无 RNase吸头（ 10L、 100L、 200L、 1000L） ； b) 酶标板 ； c) 硝酸纤维素膜（ NC膜） ； d) 无 RNase离心管 ； e) PCR反应管 ； f) 研钵 ； g) 样品袋 ； h) 标签 ； i) 镊子 。 4.3 主要 试剂 TuMV抗体、 CMV抗体、酶标二抗、 TuMV特异性引物、 CMV特异性引物、 Trizol、液氮、三氯甲烷、异 丙醇、乙醇、 M-MLV RT反转录酶、 RNA酶抑制剂、 Taq DNA聚合酶、 DNA分子标记、 Gelred、琼脂糖等。 除特殊说明外，所有实验用试剂级别均为分析纯级。 试验用水为无菌超纯水或去离子
6、水， 均符合 GB/T 6682-2008。 血清学和分子生物学检测试剂配制见附录 A。 5 检测 5.1 方法提要 芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒 的血清学特性与分子生物学特性是该病毒检测方法的主要依据。两种 病毒都具有很强的免疫原性，同时都是 RNA病 毒，因此可利用间接 ELISA、 Dot-ELISA和 RT-PCR方法确定 样品中是否带有上述两种病毒。 5.2 间接酶联免疫吸附测定 5.2.1 样品制备 将单头蚜虫置于小型离心管内，加 300L包被缓冲液研碎， 4C冰箱放置 12h 16h；称取待测植株样 品 0.1g以上，按 1： 10（质量：体积）加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆， 4
7、C冰箱放置 4h 5h。将两类 研磨液 8000r/min离心 3min，上清液即为制备好的检测样品。 设阴性对照和阳性对照，阴性对照样品为试验室保存的未感染病毒的健康大白菜叶片，阳性样品为 试验室保存的感染 TuMV或 CMV的标准样品，阴性样品及阳性样品皆通过 RT-PCR检测及测序验证。 阴性对 照、阳性对照作相 同 的处理 ，样品提取缓冲液作空白对照。 5.2.2 加样 DB 37/T 3894 2020 3 在 酶标板 上 加 入 制备好的 待 检测样品、阴性对照、阳性对照 、空白对照 ， 每个样品平行加到两个孔 中，每孔加样 100L， 加盖， 4C冰箱孵育 12h 16h。 5.
8、2.3 洗板 孵育结束后，用 PBST清洗酶标板 3次 5次。每孔每次加 PBST洗液 700L，每次停留 1min 2 min。 5.2.4 加抗血清 用抗体稀释缓冲液按照相应病毒抗血清的使用浓度进行稀释，每孔加入稀释好的抗体液 100L， 加 盖 ， 37C孵育 1.5h。 5.2.5 洗板 同 5.2.3。 5.2.6 加酶标抗体 用抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度，并加 入 到酶联板中， 100L/孔，加盖， 37C孵育 1.5 h。 5.2.7 洗板 同 5.2.3。 5.2.8 加底物缓冲液 将现配的底物缓冲液按 100L/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育 1h。 5.2.8
9、.1 读数 每孔加 100 L3 mol/L NaOH终止剂终止反应，用酶标仪在 405nm波长下测定各孔的吸光值（ OD405）。 5.3 斑点酶联免疫吸附测定 5.3.1 NC 膜制备 剪裁 7cm7cm大小的 NC膜，用铅笔在保护纸外划成 7mm7mm大小的方格，划好后 去掉保护纸备用。 5.3.2 样品制备 将单头蚜虫置于小型离心管内，加 300 LPBS磷酸盐缓冲液研碎；称取待测植株样品 0.1g以上，按 1： 10（质量：体积）加入 PBS磷酸盐缓冲液，用研钵研磨成浆。将两类研磨液 8000r/min离心 3min，上清液 即为制备好的检测样品。 设阴性对照和阳性对照，阴性对照样品
10、为试验室保存的未感染病毒的健康大白菜叶片，阳性样品为 试验室保存的感染 TuMV或 CMV的标准样品，阴性样品及阳性样品皆通过 RT-PCR检测及测序验证。 阴性对 照、阳性对照作相 同 的处理 ，样品提取缓冲液作空白对照。 5.3.3 加样 分 别取 2L制备好的 待 检测样品、阴性对照、阳性对照 、空白对照 ， 点到 NC膜的相应格子中，室温 干燥 10min。每个样品平 行在膜上重复一次。 5.3.4 封闭 DB 37/T 3894 2020 4 在平皿（ F9cm）中加入 20mL封闭液，并将干燥好的 NC膜浸入，室温下封闭 30min。 5.3.5 加抗血清 用封闭液按照相应病毒抗血
11、清的工作浓度进行稀释，并将 NC膜浸入， 室温孵育 30min 60min。 5.3.6 洗膜 将平皿中抗体液倒出，加入 PBST 20mL洗膜 3次 4次，每次 3min。 5.3.7 加酶标抗体 用抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度， 并将 NC膜浸入 ，室温孵育 30min 60min。 5.3.8 洗膜 同 5.3.6。 5.3.9 显色 显色底物 NBT 66L和 BCIP 33L加到 10mL底物缓冲液中混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物显色 液中反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应（显色 5min 20min），即在 蒸馏 水 中漂洗，肉眼观察并记录结
12、果。 5.4 逆转录 -聚合酶链式反应检测 5.4.1 总 RNA 提取 取单头蚜虫或称取 0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的无 RNase 1.5mL离心管 中，加人 1mL的 Trizol试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置 5 min； 4C， 12000g离心 10min，取上清液；加入 200L三氯甲烷，上下颠倒混匀，室温静止 15min； 4C， 12000g离心 10min，取上层水相移入新的离心管 中；加等体积的异丙醇（约 600L），轻柔颠倒混匀，室温放置 15min； 4C， 12000g离心 10min，小心弃 上清液；加 1mL预冷的 75%的乙醇洗涤沉淀，
13、 4C， 7500g离心 5min，弃乙醇；沉淀于室温下干燥 5min 10min， 溶于 30L无 RNase的 ddH2O，轻弹管壁使之溶解， -80C保存备用。设阴性对照和阳性对照，阴性对照样 品为试验室保存的未感染病毒的健康 大白菜叶片，阳性样品为试验室保存的感染 TuMV或 CMV的标准样品， 阴性样品及阳性样品皆通过 RT-PCR检测及测序验证，用超纯水作空白对照。 阴性对照、阳性对照作相应 的处理 。 5.4.2 引物合成 委托引物合成公司 进行 引物合成，引物配制成 10mol/L储存液备用， 引物序列 见 表 1。 表 1 检测引物序列 检测病毒 引物名称及序列 扩增片段大小
14、 芜菁花叶病毒 TuMV-F: 5-GTAACCAAGACCGACCATAC -3 228bp TuMV -R:5-TATGCCTCTCCGTGTTCT-3 黄瓜花叶病毒 CMV-F: 5-AACCACCCAACCTTTGTAG-3 460bp CMV-R: 5-GCTCGACGTCAACATGAA-3 5.4.3 逆转录 DB 37/T 3894 2020 5 逆转录总体积为 20L。在无 RNase的 PCR管中依次加入 3L待检测 RNA， 1L相应病毒下游扩增引物 （ 20M）， 8L无 RNase的 ddH2O，在 65C恒温 水浴 ， 放置 5 min后迅速置于冰上 5min。 再
15、向 PCR管中加 入 M-MLV RT（ 200U/L） 1 L、 RNasin（ 40U/L） 1L、 5RT缓冲液 4L、 dNTP（ 10mmol/L） 2L，混匀，置于 PCR 仪中 42C反应 1h， 70C反应 5min。同样处理阳性对照、阴性对照和空白对照，合成的 cDNA置于 -20C以 下 冰箱中保存备用。 5.4.4 PCR 扩增 依次在灭菌的 PCR管中加入 ddH2O 14.8L、 10PCR缓冲液 2.5L、 MgCl2（ 25mmol/L） 2.5L、 dNTP （ 10mmol/L） 2L、 10pmol/L上游引物 1L、 10pmol/L下游引物 1L、 Ta
16、q酶（ 5U/L） 0.2L、 cDNA模 板 1L，混匀。置于 PCR仪中，设置反应程序 95C 5min， 95C 30s， 56C 30s， 72C 1min， 35个循环后 72C 10min， 4CPCR仪中 保存。 5.4.5 琼脂糖凝胶电泳检测 制备 1%的琼脂糖凝胶。取上述 PCR产 物 10L，加入 1L上样缓冲液，混匀后移入胶孔，并在样品孔 一侧加入 DNA分子量标记， 120V电压下电泳 30min。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否 扩增出预期的特异性条带，并与阳性对照比较，拍摄并记录。 6 结果判定及表述 6.1 结果判定 6.1.1 间接酶联免疫吸附测定
17、 6.1.1.1 对照孔的 OD405值 （ 缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔 ） ，应该在质量控制范围内，即： a) 缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405值 2； d) 孔的重复性基本一致 。 以上同时具备则本批次检测有效，否则判定本批次检测无效，需重新检测。 6.1.1.2 在满足了质量 控制 要求后，结果原则上可判断如下： a) 样品 OD405值 /阴性对照 OD405值 2，判为阳性 ； b) 样品 OD405值 /阴性对照 OD405值 =2，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法验证 ； c) 样品 OD405值 /阴性对照 OD4052，判为阴性。 6.1.2 斑点酶联免疫吸附测
18、定 肉眼观察，阳性对照应出 现棕红色或深褐色圆形斑点，阴性对照应无显色斑点。 对照成立的情况下，肉眼观察各个被检测样品，凡出现棕红色或深褐色圆形斑点者判为阳性，与阴 性对照相同不出现可见斑点者判为阴性，介于两者之间判为可疑， 需重新做一次，或用其他方法验证。 重复孔结果不一致时，视此次结果无效，需进行重新验证。 6.1.3 逆转录 -聚合酶链式反应 根据阳性对照、阴性对照和空白对照的电泳图表现判断检测是否有效，如无效时，则需重新检测。 如果阴性对照和空白对照正确，待测样品出现与阳性对照一致的所测病毒的扩增条带，判定结果为 阳性。 DB 37/T 3894 2020 6 阳性对照、阴性对照和空白
19、 对照正确，且样品无扩增条带，判定结果为阴性。 6.2 结果表述 检测 结果表述如下： a) 检出 芜菁花叶病毒 或未检出 芜菁花叶病毒 ； b) 检出 黄瓜 花叶病毒或未检出 黄瓜 花叶病毒。 DB 37/T 3894 2020 7 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 A.1 间接酶联免疫吸附测定 A.1.1 包被缓冲液（ pH9.6） 碳酸钠（ Na2CO3） 1.59g，碳酸氢钠（ NaHCO3） 2.93g，溶解于 900mL蒸馏水中，用盐酸调节 pH至 9.6， 用蒸馏水定容至 1000mL。 A.1.2 PBST缓冲液（ pH7.4） 氯化钠（ NaCl） 8.0g， 磷
20、酸二氢钾（ KH2PO4） 0.2g，磷酸氢二钠（ Na2HPO4） 1.15g，氯化钾（ KCl） 0.2g， 0.5mL Tween-20，溶解于 900mL蒸馏水中，用盐酸调节 pH至 7.4，蒸馏水定容至 1000mL。 A.1.3 抗体缓冲液 PVP（ MW 24 4000）（聚乙烯吡络烷酮） 2g，脱脂奶粉 1g，溶解于 100mL PBST中。 A.1.4 底物稀释缓冲液（ pH9.8） 二乙醇胺 9.7mL，氯化镁（ MgCl2） 0.01g，溶解于 80mL蒸馏水中，用盐酸调节 pH至 9.8，用蒸馏水定 容至 100mL。 A.1.5 底物溶液（现配先用） 1mg PNPP
21、（对 -硝基苯磷酸 二 钠）溶于 1mL底物缓冲液中。 A.1.6 抗血清 病毒 特异性抗体。 A.1.7 酶标抗体 碱性磷酸酶标记抗体。 A.2 斑点酶联免疫吸附测定 A.2.1 PBS磷酸盐缓冲液（ pH7.2） 氯化钠（ NaCl） 8.0g， 磷酸二氢钾（ KH2PO4） 0.2g，磷酸氢二钠（ Na2HPO4） 1.15 g，氯化钾（ KCl） 0.2g，溶解于 900mL蒸馏水中，用盐酸调节 pH至 7.2，蒸馏水定容至 1000mL。 A.2.2 PBST缓冲液（ pH7.4） 氯化钠（ NaCl） 8.0g， 磷酸二氢钾（ KH2PO4） 0.2g，磷酸氢二钠（ Na2HPO4
22、） 1.15g，氯化钾（ KCl） 0.2g， 0.5mL Tween-20，溶解于 900mL蒸馏水中，用盐酸调节 pH至 7.4，蒸馏水定容至 1000mL。 A.2.3 封闭液 DB 37/T 3894 2020 8 取脱脂奶粉 5g加入到 100mL PBST，充分溶解， 4C保存。 A.2.4 底物稀释缓冲液（ pH9.5） TrisCl 12.11g，氯化镁（ MgCl2） 2.38g，氯化钠（ NaCl） 5.85g，溶解于 900mL蒸馏水中，用氢氧 化钠调节 pH至 9.5，用蒸馏水定容至 1000mL。 A.2.5 底物溶液（现配先用） BCIP (5 0mg/mL) 溶于
23、 100% 二甲基甲酰胺； NBT(50mg/mLl)溶于 70%二甲基甲酰胺。 每 5 mL 底物稀释缓冲液中先 加入 33L的 NBT，混匀后再加入 16.5L的 BCIP，该试剂配制好后，应 在 1h内使用。 A.2.6 抗血清 病毒特异性抗体。 A.2.7 酶标抗体 碱性磷酸酶标记抗体，为病毒特异性抗体的抗体。 A.3 逆转录 -聚合酶链式反应 A.3.1 50TAE TrisCl 242g， 冰乙酸 52.1mL， Na2EDTA2H2O 37.2g，溶解于 900mL蒸馏水中，蒸馏水定容至 1000mL。 使用时加水稀释至 1TAE。 A.3.2 上样缓冲液 0.05%溴酚蓝， 0.9%SDS， 50%甘油 水溶液。 _
