1、ICS 11.220B 41备 案 号 ： DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 793 2012口 蹄 疫 病 毒 非 结 构 蛋 白 抗 体 酶 联 免 疫 吸 附试 验 检 测 方 法 Enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibody against nonstructure proteinof foot-and-mouth disease virus 2012 -01- 06发 布 2012 -03-01实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB42/T 7932012 I 目 次前 言 .II引 言 .
2、III1 范 围 .12 缩 略 词 .13 实 验 原 理 .1 4 实 验 条 件 .15 实 验 材 料 .26 实 验 方 法 .27 结 果 判 定 .38 注 意 事 项 .3附 录 A.4附 录 B.6 DB42/T 7932012 II 前 言本 标 准 按 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草 。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院 、 武 汉
3、 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司 、 湖 北 省 动 物 疫病 预 防 控 制 中 心 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 吴 斌 、 金 梅 林 、 钱 平 、 曹 胜 波 、 陈 焕 春 、 卢 顺 、 李 淑 云 、 宋 念 华 。 DB42/T 7932012 III 引 言口 蹄 疫 (Foot-and-mouth disease, FMD)是 偶 蹄 动 物 的 一 种 急 性 、 高 度 接 触 性 传 染 病 ， 其 病 原 是 口 蹄 疫病 毒 。 该 病 传 播 途 径 多 ， 传 染 性 强 ， 发 病 率 高 ， 曾 多 次 在 世 界 上 发
4、 生 过 大 流 行 。 世 界 动 物 卫 生 组 织 （ OIE）将 本 病 列 为 必 报 传 染 病 之 首 ， 我 国 将 其 列 为 一 类 动 物 疫 病 。本 标 准 的 检 测 技 术 参 考 OIE 诊 断 试 验 和 疫 苗 标 准 手 册 （ 2009 版 ） 2.1.5 章 中 推 荐 的 方 法 ， 并 结合 起 草 单 位 在 口 蹄 疫 血 清 学 诊 断 技 术 方 面 的 研 究 基 础 编 写 制 定 。本 文 件 的 发 布 机 构 提 请 注 意 ， 声 明 符 合 本 文 件 时 ， 可 能 涉 及 到 一 种 口 蹄 疫 病 毒 非 结 构 蛋 白
5、 基 因3ABC 及 其 制 备 方 法 与 应 用 （ 专 利 号 ： ZL2003101001145） 相 关 的 专 利 的 使 用 。本 文 件 的 发 布 机 构 对 于 该 专 利 的 真 实 性 、 有 效 性 和 范 围 无 任 何 立 场 。该 专 利 持 有 人 已 向 本 文 件 的 发 布 机 构 保 证 ， 他 愿 意 同 任 何 申 请 人 在 合 理 且 无 歧 视 的 条 款 和 条 件 下 ， 就 专 利 授 权 许 可 进 行 谈 判 。 该 专 利 持 有 人 的 声 明 已 在 本 文 件 的 发 布 机 构 备 案 。 相 关 信 息 可 以 通 过
6、以 下 联系 方 式 获 得 ：专 利 持 有 人 姓 名 ： 陈 焕 春 、 顾 贫 、 曹 胜 波 、 钱 平 、 唐 勇 、 金 梅 林 、 吴 斌 、 方 六 荣 、 刘 正 飞 、 吕 建 强 。地 址 ： 武 汉 市 洪 山 区 狮 子 山 街 1 号 华 中 农 业 大 学邮 政 编 码 ： 430070联 系 电 话 ： 027-87282608传 真 ： 027-87282608请 注 意 除 上 述 专 利 外 ， 本 文 件 的 某 些 内 容 仍 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利的 责 任 。 DB42/T
7、7932012 1 口 蹄 疫 病 毒 非 结 构 蛋 白 抗 体 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 口 蹄 疫 病 毒 非 结 构 蛋 白 抗 体 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 检 测 方 法 的 缩 略 词 、 实 验 原 理 、 实 验 条件 、 实 验 材 料 、 实 验 方 法 、 结 果 判 定 和 注 意 事 项 等 。本 标 准 适 用 于 检 测 猪 血 清 中 口 蹄 疫 病 毒 非 结 构 蛋 白 的 抗 体 。2 缩 略 词下 列 缩 略 词 适 用 于 本 标 准 。ELISA（ enzyme-linked immuno
8、sorbent assay） ： 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 FMDV(foot-and-mouth disease virus) ： 口 蹄 疫 病 毒OD630nm值 ： 630纳 米 波 长 处 的 吸 光 值S： 样 品 孔 OD630nm值P： 阳 性 对 照 孔 OD630nm平 均 值3 实 验 原 理口 蹄 疫 感 染 动 物 体 内 产 生 口 蹄 疫 病 毒 结 构 蛋 白 抗 体 和 非 结 构 蛋 白 抗 体 ， 而 口 蹄 疫 疫 苗 免 疫 动 物 主 要产 生 结 构 蛋 白 抗 体 ， 因 此 可 以 通 过 检 测 非 结 构 蛋 白 的 抗 体 来 区
9、分 疫 苗 免 疫 动 物 和 野 毒 感 染 动 物 。 在FMDV各 蛋 白 的 抗 体 中 ， 非 结 构 蛋 白 的 抗 体 是 检 测 FMDV感 染 的 最 可 靠 指 标 。FMDV非 结 构 蛋 白 抗 体 ELISA检 测 技 术 是 利 用 待 检 样 品 中 的 抗 体 与 包 被 在 酶 标 板 上 的 重 组 非 结 构蛋 白 抗 原 发 生 反 应 ， 然 后 通 过 洗 涤 把 抗 原 抗 体 复 合 物 和 其 他 物 质 分 开 ； 再 加 入 酶 标 记 抗 体 （ 酶 标 二 抗 ） ，酶 标 记 抗 体 也 可 以 通 过 反 应 与 抗 原 抗 体 复
10、 合 物 结 合 ， 此 时 酶 标 板 上 的 酶 量 与 样 品 中 的 抗 体 量 成 正 比 ； 加 入 底 物 后 ， 底 物 被 酶 催 化 成 有 色 产 物 ， 有 色 产 物 的 量 与 样 品 中 抗 体 的 量 直 接 相 关 ， 故 可 根 据 OD630nm值进 行 分 析 。4 实 验 条 件4.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 常 温 （ 18 25 ） 进 行 。4.2 仪 器台 式 低 温 高 速 离 心 机 、 微 量 移 液 器 、 冰 箱 、 恒 温 箱 、 酶 标 检 测 仪 。4.3 人 员 注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护 。 DB4
11、2/T 7932012 2 5 实 验 材 料口 蹄 疫 病 毒 重 组 非 结 构 蛋 白 、 酶 标 记 抗 体 、 阳 性 对 照 血 清 、 阴 性 对 照 血 清 ； 包 被 液 、 封 闭 液 、 样 品稀 释 液 、 洗 涤 液 、 底 物 液 A、 底 物 液 B、 终 止 液 ； 试 剂 配 方 见 附 录 A。6 实 验 方 法6.1 样 品 处 理取 猪 血 液 ， 待 血 液 凝 固 后 ， 4000 r/min离 心 10 min， 收 集 血 清 。 血 清 宜 清 亮 ， 无 严 重 溶 血 。 具 体 血液 采 集 与 样 品 处 理 的 注 意 事 项 见 附
12、 录 B。6.2 包 被 用 包 被 液 将 抗 原 稀 释 到 工 作 浓 度 （ 3.1 g/mL） 加 入 酶 标 板 孔 内 ， 每 孔 100 L， 在 2 8 下 包被 14 h。6.3 封 闭取 出 抗 原 包 被 板 ， 弃 去 孔 中 的 包 被 液 ， 拍 干 ； 每 孔 加 洗 涤 液 200 L， 静 置 3 min； 弃 去 洗 涤 液 ， 加封 闭 液 ， 200 L/孔 ， 于 37 封 闭 2 h； 弃 去 封 闭 液 ， 拍 干 。 于 2 8 冷 藏 过 夜 ， 自 然 干 燥 。6.4 样 品 稀 释用 血 清 稀 释 液 按 1:40的 比 例 稀 释
13、血 清 样 品 （ 195 L样 品 稀 释 液 中 加 5 L血 清 样 品 ） ， 用 血 清 稀 释 液按 1： 4的 比 例 稀 释 对 照 血 清 （ 180 L样 品 稀 释 液 中 加 60 L对 照 血 清 ） ， 轻 轻 振 荡 混 匀 。6.5 加 样将 稀 释 好 的 待 检 血 清 和 对 照 血 清 各 取 100 L加 入 到 抗 原 包 被 板 孔 中 ， 待 检 血 清 作 1孔 ， 阴 性 对 照 和 阳 性 对 照 各 作 2孔 ， 轻 轻 振 匀 孔 中 样 品 （ 勿 溢 出 ） ， 置 37 下 温 育 30 min。6.6 洗 涤弃 掉 板 孔 中
14、的 溶 液 ， 用 洗 涤 液 洗 板 5次 ， 200 L/孔 ， 每 次 静 置 3 min后 倒 掉 液 体 ， 并 在 干 净 的 吸 水 纸上 拍 干 。6.7 加 酶 标 记 抗 体每 孔 加 酶 标 记 抗 体 100 L， 置 37 下 温 育 30 min， 按 6.6中 方 法 洗 板 5次 。6.8 加 底 物每 孔 加 底 物 液 A、 底 物 液 B各 50 L， 轻 轻 振 荡 混 匀 ， 室 温 （ 18 25 ） 避 光 显 色 10 min。6.9 终 止 反 应 每 孔 加 终 止 液 50 L， 轻 轻 振 荡 混 匀 ， 10 min内 测 定 结 果
15、。6.10 测 定 吸 光 值在 酶 标 仪 上 于 630 nm波 长 处 测 各 孔 OD630nm值 。 DB42/T 7932012 3 7 结 果 判 定试 验 成 立 的 条 件 ： 阳 性 对 照 孔 OD630nm值 均 0.8； 阴 性 对 照 孔 OD630nm值 均 0.3。如 果 S 0.3， 判 为 阳 性 ； 如 果 S 0.3， 判 为 阴 性 。8 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施 ， 废 弃 物 应 做 无 害 化 处 理 。 DB42/T 7932012 4 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）
16、试 剂 的 配 置A.1 洗 涤 液氯 化 钠 （ NaCl） 8.0 g氯 化 钾 （ KCl） 0.2 g磷 酸 氢 二 钠 (Na 2HPO412H2O) 2.9 g磷 酸 二 氢 钠 （ NaH2PO4） 0.2 g吐 温 -20（ Tween-20） 0.5 mL加 蒸 馏 水 至 1000 mL置 2 8 下 保 存 备 用 。A.2 样 品 稀 释 液牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 0.5 g加 洗 涤 液 至 100 mL置 2 8 下 保 存 备 用 。A.3 酶 标 记 抗 体用 样 品 稀 释 液 按 1:5000稀 释 ， 置 4 保 存 可 使 用 7d。 A.
17、4 底 物 液 A的 配 制磷 酸 氢 二 钠 （ Na2HPO4） 14.6 g柠 檬 酸 （ C6H8O7） 9.33 g过 氧 化 脲 （ CH6N2O3） 0.52 g加 蒸 馏 水 至 1000 mL用 HCl调 pH值 至 5.0 5.4， 置 2 8 下 保 存 备 用 。A.5 底 物 液 B的 配 制四 甲 基 联 苯 胺 （ TMB） 20 mg无 水 乙 醇 （ C 2H6O） 10 mL加 蒸 馏 水 至 1000 mL置 2 8 下 避 光 保 存 备 用 。A.6 终 止 液40%的 氢 氟 酸 (HF) 625 L加 蒸 馏 水 至 100 mL置 2 8 下 保
18、 存 备 用 。A.7 包 被 液 DB42/T 7932012 5 碳 酸 钠 （ Na2CO3） 1.59 g碳 酸 氢 钠 (NaHCO3) 2.93 g加 蒸 馏 水 至 1000 mL置 2 8 下 保 存 备 用 。A.8 封 闭 液牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 0.5 g蔗 糖 （ C12H22O11） 1 g加 洗 涤 液 至 100 mL置 2 8 下 保 存 备 用 。 DB42/T 7932012 6 BB附 录 B（ 资 料 性 附 录 ）采 样 与 样 品 处 理 注 意 事 项B.1 血 样 的 采 集 和 处 理 ， 应 进 行 无 菌 操 作 ， 防 止 样 本 因 污 染 发 生 变 质 。 存 放 血 样 的 容 器 应 无 菌 ， 可 使用 一 次 性 灭 菌 容 器 。B.2 血 液 自 然 凝 固 后 无 菌 分 离 血 清 装 入 灭 菌 离 心 管 或 小 瓶 中 ， 加 盖 密 封 后 置 2 8 下 冷 藏 保 存 。 每份 血 清 样 品 贴 标 签 并 写 明 编 号 、 采 集 地 点 、 免 疫 背 景 、 时 间 等 ， 以 便 通 过 抗 体 检 测 ， 做 出 追 溯 性 诊 断 。B.3 采 样 及 实 验 过 中 ， 应 穿 工 作 服 、 戴 口 罩 和 一 次 性 手 套 。 _
