1、湖南省地方标准 DB43 DB43/T 16702019 ICS 65.020.30 B 41 湖南省市场监督管理局 发 布 2019-10-15发布 2019-12-15实施 非洲猪瘟病毒检测 免核酸提取荧光PCR法 Detection of African Swine Fever Virus Real-time PCR without DNA Extraction Method DB43/T 16702019 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 主要仪器设备 1 5 主要耗材 1 6 试剂 2 7 样品处理 2 8 样品检测 3 9 结果判定 3
2、 10 生物安全要求 3 附录 A（规范性附录） 试剂的配制 4 DB43/T 16702019 II 前 言 本标准按GB/T 1.12009给出的规则起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省畜牧水产局提出，由湖南省农业农村厅归口。 本标准起草单位：湖南省动物疫病预防控制中心、湖南国测生物科技有限公司。 本标准主要起草人：何世成、王昌建、刘道新、喻正军、石建、范叶、林源、唐小明、黄建龙。 DB43/T 16702019 1 非洲猪瘟病毒检测 免核酸提取荧光PCR法 1 范围 本标准规定了免核酸提取检测非洲猪瘟病毒核酸的荧光PCR方法
3、。 本标准适用于我省范围内开展非洲猪瘟病毒核酸快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 非洲猪瘟 （African Swine fever，ASF） 由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）引起的猪的一种急性、
4、热性、高度接触性传染 病，其发病率和病死率均可达到100%，是世界动物卫生组织（OIE）的法定报告传染病，在我国属于一 类动物疫病。 3.2 荧光 PCR 实时荧光聚合酶链式反应（Real-time polymerase chain reaction）。 4 主要仪器设备 荧光PCR仪；台式离心机（转速12 000 r/m）；小型离心机（转速6 000 r/m）；-20冰箱；微 量移液器（0.22.5）L、（110）L、（10100）L、（20200）L、（1001 000）L等规 格；组织匀浆仪；高压灭菌锅；分析天平（精度0.01g）；生物安全柜。 5 主要耗材 无DNase/RNase 1
5、.5 mL离心管；与荧光PCR仪匹配的PCR薄壁管或8联排管；与移液器配套的各 规格吸头。 DB43/T 16702019 2 6 试剂 6.1 引物与探针 引物和探针的设计基于ASFV vp72基因序列，序列如下： a) 上游引物：5-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3，使用浓度为20 mol/L。 b) 下游引物：5-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3，使用浓度为20 mol/L。 c) 探针：5-FAM-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3，使用浓度为10 mol/L。 6.2 核酸释放剂 核酸释放剂配制方法见附录A.1。 6.3 荧光P
6、CR试剂 6.3.1 Taq DNA聚合酶，浓度为5 U/L。 6.3.2 尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶），浓度为2 U/L。 6.3.3 dNTPs：由等量dATP、dUTP、dGTP、dCTP组成，终浓度为25 mmol/L。 6.3.4 2PCR缓冲液：配制方法见附录A.2。 6.4 阴性与阳性对照 6.4.1 阳性对照：灭活的非洲猪瘟病毒阳性样品，Ct值30，-20保存备用。 6.4.2 阴性对照：非洲猪瘟病毒核酸阴性样品，-20保存备用。 7 样品处理 7.1 样品类型 猪脾脏、淋巴结等组织样品，血清、抗凝血，拭子样品。样品的采集、保存与运输按照 NY/T 541 的规定执行。 7
7、.2 样品预处理 不同类型样品预处理方法如下： a） 组织样品：剪取待检组织约50 mg置于1.5 mL离心管中，加入200 L PBS（0.01 mol/L ， pH 7.2），使用组织匀浆仪研磨成悬液，12 000 r/m离心1 min，取上清待检。 b） 血清或抗凝血样品：无需预处理。 c） 拭子样品：准备1.5 mL 离心管，加入1 mL PBS（0.01 mol/L ，pH 7.2）， 将拭子置入管中， 振荡后取浸泡液待检。 7.3 样品灭活 将预处理后的待检样品经60 30 min灭活。 7.4 样品保存 样品在28条件下保存应不超过24 h，超24h后检测需冷冻保存。 DB43/
8、T 16702019 3 8 样品检测 8.1 核酸释放 8.1.1 在样品制备区，吸取核酸释放剂100 L于1.5 mL离心管中，加入已灭活待检样品10 L 20 L，充分混匀。8595处理10 min，然后12 000 r/m离心1 min，取上清液作为模板立即进 行荧光PCR检测。同时设立阴性对照、阳性对照。 8.1.2 待检样品也可使用商品化病毒核酸提取试剂盒进行DNA提取，操作按试剂盒说明书进行。 8.2 荧光PCR检测 8.2.1 反应体系配制：根据待检样品数量，在试剂准备区按比例配制反应体系：Taq DNA聚合酶0.5 L、 UNG酶 0.25 L、dNTPs 0.25 L、2P
9、CR缓冲液12.5 L、上下游引物各0.75 L、探针0.5 L、 无DNase/RNase水4.5 L。充分混匀后，20 L/管分装，转移至样品制备区加样。 8.2.2 加样：吸取5 L模板加至反应体系，转移到扩增区。 8.2.3 扩增：将反应管置于荧光PCR仪中，选择FAM通道进行检测，设置反应体系为25L，反应程 序如下：第一阶段，预反应50/2 min；第二阶段，预变性95/2 min；第三阶段，95/15 s，退火、 延伸、荧光收集60/30 s（收集荧光）， 40个循环；第四阶段，冷却25 /10 s。 9 结果判定 9.1 基线设置 反应结束后，保存结果，仪器对结果进行自动分析，
10、给出Ct值。注意查看结果的扩增曲线的形状， 存在Ct值的结果呈S型扩增曲线。也可根据实际情况自行调整：基线起点值调至315、基线终点值 调至520，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线，使各项参数符合下述“9.2 实验有效性” 中的要求。 9.2 实验有效性 当阳性对照Ct值30、呈S型扩增曲线，阴性对照无Ct值时，实验成立，否则实验结果无效。 9.3 结果判定 样品Ct值35且呈S型扩增曲线，结果判定为ASFV核酸阳性。 样品Ct值在3540之间，结果判定可疑，需重复检测一次，复检无Ct值，判定为ASFV核酸阴性， 反之为阳性。 样品无Ct值或无S型扩增曲线，结果判定为ASFV核酸阴性
11、。 10 生物安全要求 检测过程及实验室废弃物处置应遵守GB 19489、NY/T 1948等生物安全管理相关要求。 DB43/T 16702019 4 附录A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 核酸释放剂配制方法 NaOH 0.8 g KCl 3.73 g EDTA 0.37 g Triton X-100 1 mL 加无DNase/RNase水充分溶解，并定容至1000 mL，分装备用。 A.2 2PCR缓冲液配制方法 Tris碱 24.2 g MgCl26H2O 2.03 g KCl 7.46 g (NH4)2SO4 1.3 g 甘油 80 ml 加无DNase/RNase水充分溶解，使用浓盐酸将溶液pH值调至8.3，并定容至1000 mL，分装备用。
