1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材 中氯霉素 检验 液相色谱 和 液相色谱 -质谱 法 Forensic sciences Examination methods for chloramphenicol in biological samples HPLC and LC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国
2、刑事技术标准化技术委员会毒物分析 分技术委员会 (SAC/TC 179/SC 1)提出并 归口。 本标准起草单位：北京市公安局法医检验鉴定中心 、公安部物证鉴定中心 。 本标准起草人：乔静、杨士云、袁增平、 张 文芳 、 任昕昕 、 王瑞花 、 王芳琳、于忠山 。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中氯霉素检验 液相色谱和液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材 （血、尿、肝、肾 、胃及胃内容 等） 中 氯霉素 的 高效 液相色谱（ HPLC） 定量 检验方法和 液相色谱 -质谱（ LC-MS） 定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物检材 中氯霉素的定性 分析
3、和定量分析 。 其 他 可疑 样品 中氯霉素 的定性分 析和定量分析可参照使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本 文件 的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本 文件 。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件 。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术 语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本 文件 。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对 生物检材 进行提取、净化及浓缩 ， 采 用 高效 液相色谱 法 定量 ， 液相色谱 -质谱 法 定性定
4、量 ，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和 相对 丰度 比 作为定 性判断依据； 以 峰面积 为依据 ， 采用 外标法进行定量分析。 5 试剂 和 材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水 。 除非另有说明 ， 在分析中使用的试剂均为分析纯 ， 试 剂包括： a) 甲醇（色谱纯）； b) 乙腈（色谱纯）； c) 乙酸乙酯； d) 无水硫酸钠； e) 磷酸盐缓冲液： 称 取磷酸氢二钾 （ K2HPO43H2O） 17.4g，磷酸二氢钾 （ KH2PO4） 13.6g， 加入 一定量的 水 溶解并稀释 至 1000mL， 再用磷酸调 节至 pH=6.0； f) 2%乙酸
5、/甲醇 溶液 ： 移取 乙酸 2.0mL，加入 甲醇 98mL，混匀 ； g) 1%甲醇 /水溶液： 移取 甲醇 1.0mL，加入 水 99mL，混匀 ； h) 15%甲醇 /乙腈溶液： 移取 甲醇 15.0mL，加入 乙腈 85mL，混匀 ； GA/T 2 i) 0.06%三氟乙胺 /0.06%三乙胺 /0.25%乙腈 /水溶液 ：分别移 取三氟乙胺 0.6mL，三乙胺 0.6mL， 乙腈 2.5mL 加水至 1000mL，混匀 ； j) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶 液： 根据 氯霉素 标准物质纯度和盐型换算后 ， 称取适量， 用甲醇 配 制成 1.0mg/mL 的氯霉素
6、 标准物质溶液 ， 置于冰箱中冷冻保存 。有效期 6 个月。 或采用市 售标准溶液 ； 2) 0.1mg/mL 标准工作液： 移取 1.0mg/mL 的 氯霉素 标准物质溶液 1.0mL 于 10mL 容量瓶中 ， 用甲醇定容至 10mL， 混匀 ， 密封， 置于冰箱中冷藏保存 。 有效期 3 个月。 实验中所用其 他 浓度的单一标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。 注 ： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管 ； b) 有机 微孔滤膜： 0.22m； c) 硅胶柱： 500mg； d) 固相萃取柱： Oasis MC
7、X 或 Oasis HLB 固相萃取柱或其他等效固相萃取柱 ， 使用前 依次用 甲醇、水活化 。 注： Oasis MCX、 Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器 和 设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -串联质谱仪 ： 配电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器 ； b) 高效 液相色谱 仪 ： 配二极管阵列检测器（ DAD） ； c) 电子天平； d) 离心机； e) 振荡器 ； f) 移液器 ； g) 浓缩器 。 7 操作方法
8、 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体 检材 样品 1.0g 2.0g 于具盖离 心管中 ，并按照以下任意一种方法操作： a) 加入 乙酸乙酯 8.0mL， 振荡 5min，超声 10min， 8000r/min 离心 10min， 分离 有机相；重复提 取一次，合并两次提取的有机相，过 15.0g 无水 硫酸钠 后， 置于浓缩器上 60下浓缩至 干 ， 残 留物 用 乙腈 1.0mL 溶解 ， 经有机 系 微孔滤膜过滤，供仪器分析 ； b) 加入 15%甲醇 /乙腈 溶液 8.0mL，
9、振荡 5min， 8000r/min 离心 10min， 分离 有机相；重复提取一 次，合并两次提取的有机相， 过处理好的硅胶柱 ，收集流出液 置于浓缩器上 60下浓缩至干， 残留物 用 乙腈 1.0mL 溶解 ， 经有机 系 微孔滤膜过滤，供 仪器分析。 GA/T 3 7.1.1.2 固相萃取 移取血液等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或称取铰碎的 肝 脏等 固体 检材 样品 1.0g 2.0g 于具盖离 心管中。加入 pH6.0 的磷酸盐缓冲液 5.0mL，混匀，超声 15min， 8000r/min 离心 20min，取上清液 转移 至 已 活化好的 HLB 或 MCX 固相萃
10、取柱，控制流速为 1.0mL/min， 依次用 pH6.0 的磷酸盐缓冲液 3mL、 1%甲醇 /水溶液 3mL 淋洗，控制流速为 3.0mL/min，挤干水 分 或 离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 2% 乙酸 /甲醇溶液 3mL 洗脱，控制流速为 1.0mL/min，收集洗脱液 ， 洗脱液 置于 浓缩器上 在 60下浓缩至 干 ， 残留物 用 乙腈 1.0mL 溶 解 ， 经 有机微孔滤膜过滤，供仪器分析。 7.1.1.3 质控 样品制备 取 等量相 似 基质的 空白样品 （若 无相似 基质空白 样 品可用血液替代） 两 份 于具盖离心管中 ，一份 作 为空白样品 ， 一份添加氯霉素标
11、准物质， 作为添加样品（ LC-MS添加 样品的浓度为 0.1g/mL(g)） ， 与 检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.1.2 仪器 检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 高效 液 相色谱 条件 以下三种 参考 条件 均满足检测要求。每种条件 可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调 整 ： a) 色谱 参考 条件一 ： 1) 色谱柱： XTerra MS C18 色谱 柱 （ 2.1mm150mm， 3.5m）或 其 他 等效柱 ； 注： XTerra MS C18色谱柱为 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标
12、准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2) 柱 温： 35 ； 3) 流速： 0.3mL/min； 4) 流动相及梯度洗脱程序： 见表 1； 5) 检测波长： 280nm；参考波长： 360nm； 表 1 梯度洗脱程序 时间 min 流动相 A （水） 流动相 B （乙腈） 1 95% 5% 8 10% 90% 10 95% 5% 15 95% 5% b) 色谱参考条件二 ： 1) 色谱柱： XTerra MS C18 色谱 柱 （ 2.1mm50mm， 3.5m） 或其 他 等效柱 ； 注： XTerra MS C18色谱柱为 Wat
13、ers公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2) 柱温 ： 35 ； 3) 流速： 0.4mL/min； 4) 流动相及梯度洗脱程序：见表 2； GA/T 4 5) 检测波长： 280nm；参考波长： 360nm； 表 2 梯度洗脱程序 时间 min 流动相 A （水） 流动相 B （甲醇） 1 80% 20% 5 10% 90% 7 80% 20% 10 80% 20% c) 色谱参考条件三 ： 1) 色谱柱： Nova-Pak C18 色谱柱 （ 3.9mm150mm， 4m） 或其它等
14、效柱 ； 注： Nova-Pak C18色谱柱为 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。 2) 流动相及梯度洗脱程序：见表 3； 3) 流速 1.0mL/min； 4) 检测波长： 288nm；参考波长： 360nm； 5) 柱温： 38 。 表 3 梯度洗脱程序 时间 min 流动相 A （甲醇） 流动相 B （乙腈） 流动相 C （ 0.06%三氟乙胺 /0.06%三乙胺 /0.25%乙腈的水溶液） 0 10% 10% 80% 15 0% 100% 0% 18 10% 10%
15、 80% 7.1.2.1.2 液相色谱 -质谱仪条件 色谱条件同 7.1.2.1.1 a)或 b)。 以下为质谱参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进 行调整： a) 碰撞气 ： 氮气； b) 扫描时间 ： 1s； c) 雾化电压： 5kV； d) 雾化电流 ： 0.36A； e) 毛细管电压： 34V； f) 温度： 300 ； g) 吹扫气 ： 5psi； h) 鞘流气 ： 50psi； i) 补偿气 ： 10psi； j) 检测器电压： 1.5kV； k) 扫描方式： 多反应 监测 方式 （ MRM） 扫描， 定性 离子对为 321/257、 321/194、 321/152
16、，定量 离子对 为 321/257； l) 碰撞电压： 15V； m) 管透镜电压： 110V； n) 离子源： 电喷雾 离子源 ； o) 检测方式：负离子 。 GA/T 5 7.1.2.2 进样 分别吸取各检材 、空白和添加样品提取液 及 标准工作液 ，按 7.1.2.1 分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材 样品 1.0g 2.0g两份 ， 按 7.1.1进行操作。 另取等量 相似 基质的空白样品 三 份， 其中 两份分别添加 氯霉素 标准 物质 作为添加样品 （ 添加样品中 目标物含量应
17、为检材 样品 中目标物含量的 (10050)%），另一份 作为空白样品，与检材 样品平行 操作 ， 得到 空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析 。 7.2.2.2 进样 分别吸取 检材、空白和添加样品提取液 及标准工作溶液 ，按 7.1.2.1 的 分析 条件每个样品进样分析 2 3 次。若要报告测量不确定度，每个样品 分析次数应 不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算 含量 记录各样品 提取液 中 平行进样 2 3 次 的 目标物 保留时间和 峰面积值 ， 按公式 （ 1） 计算含量：
18、 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材 样品中 目标 物 的 含量 ，单位为微克每克 （ g/g） 或 微克每毫升 （ g/mL） ； A 样 检材 样品提取液 中目标物峰面积 平均值 ； M 添 添加样品中标准物质添加量，单位为微克 （ g） ； V 样 检材 样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） ； A 添 添加样品 提取液 中目标物峰面积 平均值 ； M 样 检材 样品 的取样 量 ，单位为克 （ g） 或 毫升 （ mL） ； V 添 添加样品的定容体积 ，单位为毫升 （ mL） 。 7.2.3.2 相对相差 记录 两 份平行操作的 检材 样品 中目标物
19、 的 含量，按公式 （ 2） 计算相对相差： %10021 = X XXRD . (2) 式中： GA/T 6 RD 相对相差 ， 用百分比（ %）表示 ； X1、 X2两个 检材 样品平行定量测定的含量数值； X 两个 检材 样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进 行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的 标准溶液相比，相对偏差不超过表 4规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。
20、表 4 离子对相对丰度比的最大允许偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品 中出现与目标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物 。 LC-MS 分析， 氯霉素的 检出限 、 相关 实验 数据及图谱 参见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量的 RD 20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验 。 GA/T 7 附
21、 录 A （资料性附录） 氯霉素 的 相关 实验 数据及 图谱 A.1 氯霉素相关 实验数据 氯霉素相关的回收率见表 A.1和表 A.2。 表 A.1 两 种添加浓度回收率（缓冲液 pH=6.0， MCX柱萃取） 添加 量（ n=3） g 回收率 RSD 0.5 71.7% 5.21% 5.0 70.3% 6.94% 注： n表示样品平行操作份数。 表 A.2 两 种提取方法回收率（缓冲液 pH=6.0，添加氯霉素 2.5g） 提取方法（ n=3） 回收率 RSD MCX 柱 70.1% 4.34% HLB 柱 69.1% 6.21% 注： n表示样品平行操作份数。 本方法 氯霉素的检出限为
22、20ng/mL（ g） A.2 氯霉素 相关 谱图 氯霉素相关色谱图见图 A.1图 A.4。 R T : 0 . 0 9 - 4 . 4 9 S M : 7G 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 3 . 0 3 . 5 4 . 0 T i m e ( m i n ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e lat ive A bu ndance 2 . 4 4 4 . 4 3 3 . 6 4 4 . 2 63 . 7 4 4 . 0 1 3 . 6 03 . 4 83 . 1 2
23、 2 . 3 4 2 . 7 20 . 8 6 1 . 9 80 . 2 5 1 . 4 6 2 . 2 51 . 0 5 1 . 2 7 1 . 5 8 0 . 5 1 0 . 6 5 N L : 5 . 3 3 E 2 T I C M S l m s - 1 R e lat ive A bu ndance R e lat ive A bu ndance 图 A.1 氯霉素 LC-MS总离子流图 GA/T 8 l m s - 1 # 553 R T : 2 . 4 4 AV: 1 NL: 6 . 0 1 E1 T: I T M S - p ESI F u l l m s 2 3 2 1 .
24、0 0 c i d 1 5 . 0 0 1 0 0 . 0 0 - 3 5 0 . 0 0 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/ z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti v e Ab u n d a n ce 2 5 6 . 9 2 1 9 4 . 0 0 3 2 0 . 9 2 2 4 9 . 0 0 1 5 2 . 0 8 1 4 7 . 8 3 1 7 5 . 9 2 2 3 6 . 9 22 1 8 . 8 3 2 5 8 . 3 32 1 9 . 9 21 9 5 . 5 0 3 2 2 . 8 31 5 4 . 8 3 1 7 8 . 6 7 R e la ti v e Ab u n d a n ce 图 A.2 氯霉素 二级 质谱图 图 A.3 氯霉素的 HPLC色谱图 (tR=9.359min) GA/T 9 图 A.4 氯霉素的紫外光谱图
