1、ICS 65.020.30 B 43 DB12 天津市 地方标准 DB12/T 956 2020 奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大 肠埃希氏菌的测定 酶底物法 Determination of total coliforms, fecal coliforms and Escherichia Coli in dairy farm manure Enzyme substrate method 2020 - 08 - 18发布 2020 - 10 - 01实施 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 9562020 1 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标
2、准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：农业农村部环境保护科研监测所、军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医 学研究所。 本标准主要起草人： 赵润、李辰宇、王景峰、张克强、谌志强、杜连柱、梁雨 。 DB12/T 9562020 2 奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底 物法 1 范围 本标准规定了基于酶底物法测定规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的技 术要求及操作方法。 本标准适用于规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的同时测定 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注
3、日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27522 2011 畜禽养殖污水采样技术规范 HJ 1001 2018 水质 总大肠菌群，粪大肠菌群和大肠埃希氏菌测定 酶底物法 3 术语和定义 HJ 1001 2018界定的 以及 下列术语和定义适用于本文件 ，为了方便使用，以下重复列出了 HJ 1001 2018中的某些术语和定义 。 3.1 总大肠菌群和粪大肠菌群 total coliforms and fecal coliforms 奶牛场粪污中常见的 肠杆菌科细菌，
4、恒温（总大肠菌群： 37 ；粪大肠菌群： 44.5 ）培养后 可 分解选择性培养基中的邻硝基苯 - -D-吡喃半乳糖苷（ ONPG）生成 黄色 邻硝基苯酚。 3.2 大肠埃希氏菌 Escherichia Coli 俗称大肠杆菌 ， 恒温 37 培养后 既能够分解选择性培养基中的邻硝基苯 - -D-吡喃半乳糖苷（ ONPG） 生成邻硝基苯酚，同时可以分解 4-甲基伞形酮 - -D-葡萄糖醛酸苷（ MUG）释放 4-甲基伞形酮，在 365 nm 紫外光源照射下显蓝色。 HJ 1001 2018，定义 3.3 3.3 最大可能数 most probable number（ MPN） 一种基于泊松分布
5、的 间接 计数方法。根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性 数，查表 估算一定体积样品中 目标微生物存在数量。 HJ 1001 2018，定义 3.4 4 粪污样品采集 DB12/T 9562020 3 4.1 采样 物品 采样容器应使用一次性无菌容器，或经 121 、 20 min高压灭菌处理。其余采样工具、文具、器具、 防护用品按照 GB/T 27522 2011中第 4.1款 规定执行。 4.2 采样 方法 按照 GB/T 27522 2011中第 4.4.2款 的规定执行。 4.3 样品保存 采样后应在 低温（ 4 ） 条件下 保存 并 在 6 h内完成 测定 。 5
6、酶底物测 定 5.1 方法 原理 在选择性培养基中培养 18 h 24 h，总大肠菌群和粪大肠菌群能够产生 -半乳糖苷酶并分解培养 底物中的邻硝基苯 - -D-吡喃半乳糖苷（ ONPG）生成邻硝基苯酚（ ONP），该物质在白光或日光照射下显 黄色。大肠埃希氏菌可以分解 4-甲基伞形酮 - -D-葡萄糖醛酸苷（ MUG）释放 4-甲基伞形酮，在 365 nm 紫外光源照射下显蓝色。计数 97孔板中阳性单元格出现数量，查 MPN表 ， 分别计算样品中总大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的浓度值。 5.2 试剂材料 5.2.1 分析时 应 使用符合 GB/T 6682 2008 中 三级水规定要求
7、的实验用水，并 经 121 、 20 min 高压 灭菌 后使用。 5.2.2 培养基 宜 采用 HJ 1001 2018 中第 6.1 款规定的 Minimal Medium ONPG-MUG 培养基。每 100 mL 预处理后的样品应使用培养基粉末 2.7 g 0.5 g ， 培养基可采用市售商品化培养基制品 ， 成分 见表 1。 表 1 培养基成分表 单位为毫克 名称 数量 硫酸铵 （ NH4） 2SO4 500 硫酸锰（ MnSO4） 0.05 硫酸锌（ ZnSO4） 0.05 硫酸镁（ MgSO4） 10 氯化钠（ NaCl） 1000 氯化钙（ CaCl2） 5 亚硫酸钠（ Na2
8、SO3） 4 两性霉素 B（ Amphotericin B） 0.1 邻硝基苯 - -D-吡喃半乳糖苷（ ONPG） 50 4-甲基伞形酮 - -D-葡萄糖醛酸苷（ MUG） 7.5 茄属植物萃取物（ Solanium 萃取物） 50 N-2-羟乙基哌嗪 -N-2-乙磺酸钠盐（ HEPES 钠盐） 530 N-2-羟乙基哌嗪 -N-2-乙磺酸（ HEPES） 690 DB12/T 9562020 4 5.2.3 97 孔定量盘：具有 48 个标准孔格， 1 个大孔格和 48 个小孔格，经环氧乙烷灭菌的市售商品 化成品。 5.2.4 标准阳性比色盘。 5.3 仪器设备 5.3.1 恒温培养箱 ：
9、 允许温度偏差 37 1 、 44.5 0.5 。 5.3.2 小型熨斗： 用于 97 孔定量盘（ 5.2.3）的封口。 5.3.3 移液管： 一次性无菌塑料吸管， 也可采用计量合格的可调式移液器。 5.3.4 实验室常用仪器设备， 121 高压灭菌 20 min 后备用。 5.3.5 紫外灯： 具有 365 nm 中心波长的光源 。 5.3.6 电子天平：量程大于 200 g，精度不小于 0.1 g。 5.4 样品前处理 使用电子天平 （ 5.3.6） 准确称量样品 2 g（精确到 0.1 g） 或 使用移液管 （ 5.3.3） 吸取样品 2.0 mL 按 4.2中方法采集的粪污样品置于盛有
10、 198 mL生理盐水的无菌匀质袋中，手持震荡 无菌 均质袋 2 min，静 置观察样品状态，当样品中含有大颗粒固体样品时使用手指碾压粉碎并继续震荡直至样品 形成悬浊液， 过 0.25 mm尼龙筛制成 10-2稀释液。用移液管 （ 5.3.3） 吸取上述稀释液 1 mL加入到 99 mL无菌水中，依次 稀释分别得到 10-4、 10-6等浓度稀释液。 5.5 接种 定容制备 100 mL样品或稀释样品于现场采样袋或采样瓶中，加入 2.7 g培养基（ 5.2.2）粉末，震荡 均匀并静置 5 min，待培养基 混匀溶解后，将样品均匀倒入 97孔定量盘（ 5.2.3）内（保证每个孔内充满 样品液），
11、 使 用 小型熨斗 （ 5.2.3） 从 97孔定量盘（ 5.2.3）底部缓慢匀速熨烫至顶部， 将 97孔定量盘（ 5.2.3） 完全密封。未培养前观察孔内颜色，若出现类似或深于标准阳性比色盘（ 5.2.4）的颜色时，应观察样 品浊度，停止实验 并 重新取样过滤制备样品。 5.6 培养 测定 总大肠菌群和大肠埃希氏菌时，将接种后的 97孔定量盘样品放入恒温培养箱（ 5.3.1）中 37 0.5 下培养 18 h后进行判读，当 97孔定量盘中孔格颜色弱于标准阳性比色盘（ 5.2.4）时，应进一 步延长培养时间至 24 h再进行判读 。 测定 粪大肠菌群时，将接种后的 97孔定量盘放入的恒温培养箱
12、 （ 5.3.1）中 44.5 0.5 下培养 18 h后进行判读，当 97孔定量盘中孔格颜色弱于标准阳性比色盘 （ 5.2.4）时，应进一步延长培养时间至 24 h再进行判读 。 5.7 结果分析 5.7.1 结果判读与计数 接种培养后的 97孔定量盘在日光或白色光源照射下呈黄色即为总大肠菌群或粪大肠菌群阳性；在紫 外灯（ 5.3.5）照射下呈蓝色即为大肠埃希氏菌阳性。 分别记录 97孔定量盘中大孔和小孔的阳性孔数量。 5.7.2 结果计算 从 97孔定量盘法 MPN表（见附录 A）中查得每 100 mL样品 MPN值后，再根据样品不同的稀释度，按照 公式 （ 1） 换算样品中总大肠菌群、粪
13、大肠菌群数或大肠埃希氏菌浓度（ MPN/L）： DB12/T 9562020 5 C=(MPN1000)/f (1) 式中： C 样品浓度， MPN/L； MPN值 查得每 100 mL样品 MPN值， MPN/100 mL； 1000 单位转换因子（由 MPN/mL转换为 MPN/L）； F 最大接种量， mL； 测定 结果保留两位有效数字 ，结果大于等于 100时以科学计数法表示 ；若 97孔均为阴性，报告目标 微生物未检出。 5.7.3 检出限 本方法的检出限为 10 MPN/L。 6 注意事项 6.1 每批次实验应使用无菌水进行至少 1 次空白 实验 ， 若 有阳性结果出现，该批次实验结果作废并查 明原因。 6.2 与样品接触过的容器和废弃物应经 121 高 压 灭菌 20 min。 DB12/T 9562020 6 A A 附 录 A （资料性附录） 97孔定量盘法 MPN表（ MPN/100 mL） 表 A.1 97孔定量盘法 MPN表 DB12/T 9562020 7 DB12/T 9562020 8 DB12/T 9562020 9 DB12/T 9562020 10 DB12/T 9562020 11 DB12/T 9562020 12 DB12/T 9562020 13 _
