1、ICS 13.060 B 21 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3111 2019 水质 肠球菌的测定 固定底物技术酶底物法 Water quality Determination of Enterococci Defined substrate technology enzyme substrate method 2019- 02 - 28 发布 2019- 03 - 28 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3111 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 方法原理 . 1 5 试剂和材料
2、. 2 6 仪器和设备 . 2 7 样品 . 3 8 分析步骤 . 3 9 结果计算与表示 . 4 10 精密度和准确度 . 4 11 质量保证和质量控制 . 5 12 废物处理 . 5 13 注意事项 . 5 附录 A . 6 DB21/T 3111 2019 II 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写起草制订。 本标准附录 A为规范性附录。 本标准由大连市市场监督管理局提出。 本标准由辽宁省生态环境厅归口。 本标准起草单位：大连市环境监测中心、国家海洋环境监测中心。 本标准主要起草人：王中卫、明红霞、李翔宇、沈学崴、李玉璞、苏洁、曲翊、
3、王琳琳、刘子成、 孙沛雯、刘景泰、韩佳。 DB21/T 3111 2019 1 水质 肠球菌的测定 固定底物技术酶底物法 1 范围 本标准规定了测定水中肠球菌的固定底物技术酶底物法。 本标准适用于地表水、地下水、饮用水、海水、生活废水和工业废水中肠球菌的测定。 本标准 的检出限：地表水、地下水、饮用水、生活废水、工业废水样品的检出限为 1 CFU/100 ml， 海水样品的检出限为 10 CFU/100 ml。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB
4、/T 5750.2 生活饮用水标准检验方法 样品的采集与保存 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 17378.7 海洋监测规范 第七部分：近海污染生态调查和生物监测 HJ/T 164 地下水环境监测技术规范 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 肠球菌 Enterococci 41 培养 24 h，能产生 -半乳糖苷酶（ - -galactosidase），分解选择性培养基中的 4-甲基 伞形酮 - - -葡萄糖醛酸苷（ 4-methyl-umbelliferyl- - -glucoside， MUG）释放出荧光物质
5、（ 4- 甲基伞形酮）的革兰氏阳性菌。 3.2 最大可能数 most probable number（ MPN） 又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释 度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积 存在目标微生物的最大可能数）。 4 方法原理 DB21/T 3111 2019 2 在特定温度下培养特定的时间，肠球菌能产生 -半乳糖苷酶，分解荧光底物 释放出荧光产物，在 366 nm紫外灯照射下产生特征性荧光。统计荧光反应出现数量，查 MPN表，计算样品中肠球菌的浓度值。 5 试剂和材料 除非另有说明
6、，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，符合 GB/T 6682 三级标准的蒸馏水或 去 离子水。 5.1 培养基 市售 Enterolert培养基，也可以使用其他等效产品。 5.2 硫代硫酸钠溶液： （ Na2S2O3 5H2O） =0.10 g/ml 称取硫代硫酸钠 （ Na2S2O3 5H2O） 10.0 g，溶于适量实验用水，定容至 100 ml，临用现配。 5.3 乙二胺四乙酸二钠溶液： （ C10H14N2O8Na2 2H2O） =0.15 g/ml 称取乙二胺四乙酸二钠 （ C10H14N2O8Na2 2H2O） 15.0 g，溶于适量实验用水，定容至 100 ml，此溶液 保质
7、期为 30 d。 5.4 无菌水 实验用水经 121 高压蒸汽灭菌 20 min，备用。 6 仪器和设备 6.1 恒温培养箱：能够恒温至 41 ，控温精度 0.5 。 6.2 高压蒸汽灭菌器：能够加热至 121 。 6.3 紫外灯：台式， 366 nm。 6.4 封口机： 用于定量盘的封口。 6.5 采样瓶： 具螺旋帽或磨口塞的 250 ml玻璃瓶。 6.6 三角瓶 :100 ml。 6.7 97 孔定量盘。 6.8 一般实验室常用仪器和设备 。 DB21/T 3111 2019 3 注：移液管、量筒、采样瓶、三角瓶等玻璃器皿和采样器具应按无菌操作要求包扎，于 121 高压蒸汽灭菌 20 mi
8、n， 烘干，备用。灭菌后的采样瓶，两周内未使用，需重新灭菌。 7 样品 7.1 样品采集与保存 按照 GB/T 5750.2、 GB 17378.7、 HJ/T 164 和 HJ/T 91 的相关规定进行样品采集。 采样后水样应 在 4下冷藏保存， 6 h内开始检测。 7.2 干扰和消除 7.2.1 含活性氯（余氯）的水样，在采样瓶灭菌前需加入 0.2 ml硫代硫酸钠溶液。 7.2.2 含 重金属的水样，在采样瓶灭菌前需加入 0.6 ml乙二胺四乙酸二钠溶液。 8 分析步骤 8.1 样品稀释 根据水样污染程度确定稀释度，避免接种水样经培养后出现全部阳性或全部阴性。接种量小于 100 ml时，水
9、样应制成稀释样品后使用，接种量为 10 ml时，以无菌操作方法取 10 ml水样加入到装有 90 ml 无菌水的三角瓶（ 6.6）中混匀制成 1:10（稀释度）稀释的样品，其它接种量的稀释样品依次类推。 注：海水样品至少经 1:10稀释后再进行检测。 8.2 接种 以无菌操作方法量取 100 ml原水样或稀释样品于三角瓶（ 6.6）中，加入 1支培养基（ 5.1），充分 混匀，完全溶解后，全部倒入 97孔定量盘（ 6.7）内，以手抚平定量盘（ 6.7）背面，去除孔内气泡，然 后用封口机（ 6.4）封口。 8.3 培养 将封口后的 97孔定量盘（ 6.7）放入培养箱（ 6.1）中培养 24 h。
10、 8.4 对照试验 8.4.1 空白对照 使用无菌水（ 5.4）进行实验室空白测定，培养后的 97孔定量盘（ 6.7）不得有荧光产生，否则，该 次样品测定结果无效，应重新测定。 8.4.2 阴性及阳性对照 DB21/T 3111 2019 4 阳性菌株参考使用粪肠球菌（ Enterococcus faecalis） ,阴性菌株参考使用粘质沙雷氏菌（ Serratla marcescens）和绿脓杆菌（ Aerococcus viridians）。将菌株 配制成 0.5 麦氏浊度的菌悬液 按照 8.2 和 8.3要求操作，阳性菌株应呈阳性反应（有荧光），阴性菌株呈阴性反应（无荧光），否则该批次测
11、 定结果无效，应重新测定。 8.5 结果判读与计数 将培养 24 h后的 97孔定量盘（ 6.7）进行结果判读，水样在紫外灯（ 6.3）照射下有荧光，则判断为 肠球菌阳性。若结果可疑，可延长培养时间到 28 h进行结果判读，超过 28 h后出现的荧光反应不作为阳 性结果。 9 结果计算与表示 9.1 结果计算 从 97孔定量盘法 MPN表（附录 A）中查得每 100 ml水样中肠球菌的 MPN值，再根据样品不同的稀释度 进行计算，每 100 ml水样中肠球菌的计算公式如下： 式中： C 每 100 ml水样中肠球菌浓度， CFU/100 ml； MPN值 查表得到的 MPN值， CFU/100
12、 ml； f 接种样品的稀释度。 9.2 结果表示 测定结果保留两位有效数字，大于等于 100时以科学计数法表示，结果单位为 CFU/100 ml。 10 精密度和准确度 10.1 精密度 多家实验室分别对肠球菌有证标准样品（ 22137 CFU/100 ml）和低浓度（ 5CFU/100 ml）、中浓 度（ 980CFU/100 ml）、高浓度 (114500 CFU/100 ml)实际样品进行了测定，实验室内的相对标准偏差范 围分别为： 4.3% 5.9%、 14% 22%、 2.4% 4.0%、 1.1% 1.4%；实验室间的相对标准偏差分别为： 0.81%、 11.2%、 0.92%、
13、 0.34%；重复性限为 0.32、 0.42、 0.25、 0.15；再现性限为 0.32、 0.46、 0.25、 0.14。 10.2 准确度 多家实验室对肠球菌有证标准样品（ 22137 CFU/100 ml）进行测定，实验室内相对误差的范围是 -1.4% -2.9%，相对误差的最终值为 -2.0% 1.6%。 注：微生物检测数据为偏态分布，其测定结果全部经以 10为底对数转换后进行计算。 DB21/T 3111 2019 5 11 质量保证和质量控制 每批次样品均需进行空白对照试验。每批次实验至少取待测样品数量的 10 %，进行平行双样分析 , 其检测所得数值全部经对数（以 10 为
14、底）转换后数值的相对标准偏差 25%。不同批次培养基需用有证 标准菌株 /标准样品进行培养基质量检验，其测定值应在保证值范围内。 12 废物处理 实验产生的废物经 121 高压蒸汽灭菌 20 min 后，作为一般废物处理。 13 注意事项 在进行结果判读时，实验人员应带手套在黑暗环境下进行，确保荧光对准定量盘，避免直射眼睛和 皮肤。 DB21/T 3111 2019 6 附录 A （规范性附录） 97孔定量盘法 MPN表（ CFU/100 ml） 大孔阳 性格数 小孔阳性格数 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 0 2419.6 _
