1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4656.7 2020 进出口纺织品生物安全检验方法 第 7 部分：铜绿假单胞菌 Biosafety testing methods of the textiles for import and export Part 7 ： Pseudomonas aeruginosa 2020-08-27 发布 2021-03-01 实施 ICS 59.080.99 W 09 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 4656.72020 前 言 SN / T 4656进出口纺织品生物安全检验方法
2、，共分为以下几个部分： 第 1 部分：白假丝酵母菌； 第 2 部分：大肠埃希氏菌； 第 3 部分：大肠菌群； 第 4 部分：金黄色葡萄球菌； 第 5 部分：菌落总数； 第 6 部分：沙门氏菌； 第 7 部分：铜绿假单胞菌； 第 8 部分：通则 本部分为 SN / T 4656 第 7 部分。 本部分按照 GB / T 1.12009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国石家庄海关。 本部分主要起草人：李轲、郭会清、禹建鹰、郭华麟、连素梅
3、、徐超、乔晴。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 4656.72020 进出口纺织品生物安全检验方法 第 7 部分 : 铜绿假单胞菌 1 范围 SN / T 4656 的本部分规定了进出口纺织品中铜绿假单胞菌的检验方法。 本部分适用于进出口纺织品铜绿假单胞菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB / T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 SN / T 15
4、38.1 培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN / T 1538.2 培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测试实用指南 SN / T 4656. 8 进出口纺织品生物安全检验方法 第 8 部分：通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 纺织品生物安全 biosafety of textiles 纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所 采取的一系列有效预防和控制措施。 3.2 铜绿假单胞菌 pseudomonas aeruginosa 也称绿脓杆菌，直或微弯革兰氏阴性、需氧、无芽孢杆菌，能够利用乙酰胺作
5、为碳源，并分解 乙酰胺产碱；能还原硝酸盐、液化明胶、在 42 条件下生长良好，具有致死率高、溶血性强、抗药 性强等特性。本菌在自然界分布广泛，主要的生长条件是潮湿环境，其它条件要求不高，可暂时寄生 于皮肤，因此接触性体表感染率相当高。 3.3 环介导恒温扩增 loop-mediated isothermal amplification;LAMP 根据目标菌特有的靶序列保守基因设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个 独立区域，利用 Bst DNA 聚合酶启动循环链置换反应，在等温条件下保温 30 min 60 min 特异、高 效、快速的完成核酸扩增。从 dNTP 析出的焦磷酸根离
6、子与反应溶液中的 Mg 2+ 结合，产生副产物（焦 磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。 以正式出版文本为准 2 SN/T 4656.72020 4 材料和设备 4.1 无菌剪刀、镊子。 4.2 电子天平：感量 0.01 g。 4.3 无菌均质袋。 4.4 拍击式均质器：400 mL。 4.5 无菌规格板：20 cm 2 。 4.6 无菌干燥棉拭子。 4.7 微量移液器：量程 0.5 L 20 L，量程 100 L 1 000 L，量程 1 mL 10 mL。 4.8 无菌小三角瓶：25 mL。 4.9 无菌玻璃平皿或一次性无菌塑料平皿：15 mm90 mm。 4
7、.10 无菌 L 形玻璃捧。 4.11 恒温培养箱：36 1 、42 1 。 4.12 接种环。 4.13 显微镜：10 100。 4.14 全自动微生物生化鉴定系统。 4.15 灭菌离心管：1.5 mL。 4.16 高速冷冻离心机：2 000 r / min 13 000 r / min。 4.17 LAMP 反应管。 4.18 水浴锅：65 1 。 4.19 LAMP 实时浊度仪。 5 培养基和试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；分子检测实验用水符合 GB / T 6682 中一级水的 要求。 5.1 无菌生理盐水：见 A.2。 5.2 SCDLP 液体培养基：见 A.3。 5
8、.3 乙酰胺琼脂：见 A.4。 5.4 革兰氏染色液：见 A.5。 5.5 氧化酶试剂：见 A.6。 5.6 硝酸盐蛋白胨水培养基：见 A.7。 5.7 营养琼脂：见 A.8。 5.8 灭菌双蒸水。 5.9 10LAMP 扩增缓冲液：含 200 mmol / L Tris- HCl（pH8.8）、100 mmol / L 硫酸铵、500 mmol / L 氯化钾、20 mmol / L 硫酸镁、1% Tween20。 5.10 引物：根据铜绿假单胞菌的 ETA 基因保守序列，设计一套 LAMP 特异性引物。 外引物 F3 ：5-TCTTCGGGCAGCTCCG-3 外引物 B3 ：5-TGGA
9、GGTTGGCCGAACTC-3 内引物 FIP ：5-GCACATCCCGTGGTGCGTG-CAGCGGCGTGGGAGTT-3 内引物 BIP ：5-TGGAACGGGGTGGCTTGG-ATAGCGCCCCGAAACCG-3 环引物 LoopF ：5-CAAGTGCCCGTATTGCGAC-3 环引物 LoopB ：5-ACGGCGGGGCGGGGTGGAG-3 以正式出版文本为准 3 SN/T 4656.72020 5.11 100 mmol / L MgSO 4 。 5.12 10 mmol / L 脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合物：每种核苷酸浓度 10 mmol / L。 5.1
10、3 Bst DNA 聚合酶 ：8 U / L。 5.14 显色液：SYBR Green I 染料，1 000。 5.15 铜绿假单胞菌标准菌株。 6 样品制备 6.1 称量法 无菌方法打开送检样品，用无菌剪刀（4.1）均匀剪样，在电子天平（4.2）上准确称取剪下的 样品 25 g，剪碎后加入到盛有 225 mL 无菌稀释液的无菌均质袋 (4.3) 中，用拍击式均质器 (4.4) 拍打 1 min 2 min，充分混匀，得到一个 1:10 的样品匀液。 6.2 多点采样洗脱法 无菌方法打开送检样品，在样品四周和中间均匀布控 5 个采样点，用无菌规格板（4.5）按每个 采样点按 4 cm5 cm（
11、20 cm 2 ）面积范围剪裁，每 20 cm 2 采样面积为 1 份检样，每件样品共采集 5 份 检样,采样面积为100 cm 2 。将上述采集好的5份检样放入盛有200 mL无菌稀释液的无菌均质袋(4.3)中， 用拍击式均质器 (4.4) 拍打 1 min 2 min，充分混匀，制成的样品匀液作为原液。 6.3 棉拭子涂抹法 无菌方法打开送检样品，用无菌稀释液湿润无菌干燥棉拭子（4.6），在样品四周和中间均匀布控 5 个采样点，用无菌规格板（4.5）比照按每个采样点 20 cm 2 面积范围均匀涂抹，每个采样点用 1 个 无菌干燥棉拭子（4.6），在 4 cm5 cm（20 cm 2 ）面
12、积范围均匀涂抹，立即用无菌剪刀（4.1）剪去棉 拭子手接触部分，将涂抹部分一块放入盛有 50 mL 无菌稀释液的无菌均质袋（4.3）中混匀，制成 1:10 的样品匀液。 6.4 样品制备方法的选择 6.4.1 样品制备一般依 6.1 方法为基准方法。 6.4.2 当样品为面积较大或较厚实或多孔时，样品制备应采用 6.2 方法。采用 6.2 方法时如果被检样品 面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。 6.4.3 当样品质地致密，不容易剪碎制备；或样品较贵重，客户要求无损检测的，样品制备应采用 6.3 方法。 6.4.4 采用 6.1、6.2 方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品匀
13、液转种时，稀释液可适 当增加直至足够吸出转种。 7 方法一 铜绿假单胞菌定量检验方法 平板计数法 7.1 原理 铜绿假单胞菌具有乙酰胺酶 , 能利用乙酰胺作为碳源，并分解乙酰胺产碱。样品接种乙酰胺培养 基后，目标菌能使乙酞胺培养基变红；结合铜绿假单胞菌具有氧化酶阳性、能使硝酸盐还原产气和在 42 生长的特性，准确判定铜绿假单胞菌。 7.2 检验程序 检验程序见图 1。 以正式出版文本为准 4 SN/T 4656.72020 24h2h361 10倍系列稀释 按6.1、6.2、6.3制备的生理盐水样品匀液 42生长试验 无可疑菌落 结果报告 硝酸盐还原产气试验氧化酶试验染色观察 选择2个3个连续
14、的适宜稀释度的样品匀 液，接种乙酰胺琼脂平板 挑取可疑菌落做确证试验 图 1 铜绿假单胞菌平板计数检验程序 7.3 操作步骤 7.3.1 样品的稀释 用微量移液器（4.7）移取制备好的样品匀液 1 mL ，缓慢注于盛有 9 mL 无菌生理盐水 (5.1) 的无 菌小三角瓶（4.8）中（注意吸头尖端不要触及液面），振摇小三角瓶或换用 1 支无菌吸头反复吹打使 其混合均匀，制成下一稀释度的样品匀液。按照以上操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递 增稀释 1 次，换用 1 次无菌吸头。 7.3.2 样品接种 根据样品的实际污染情况，选择 2 个 3 个合适的稀释度样品匀液（包括原液），每个稀
15、释度分 别吸取 1 000 L 样品匀液以500 L、500 L 的接种量分别接种两块表面干燥的乙酰胺琼脂（5.3）平板， 然后用无菌 L 形玻璃捧（4.10）均匀涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。如样液不易吸收，可将 平板放在 36 1 恒温培养箱（4.11）培养 1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，培 养 24 h2 h。 7.3.3 典型或可疑菌落计数 铜绿假单胞菌在乙酰胺琼脂（5.3）平板上菌落形态：乳白色扁平菌落，湿润，边缘整齐，菌落 周围培养基颜色变红。挑选有典型或可疑铜绿假单胞菌菌落，且同一稀释度的两个平板所有典型或可 疑菌落数合计在 20 CFU 200 CFU
16、范围内的平板，计数其典型或可疑菌落数。 以正式出版文本为准 5 SN/T 4656.72020 7.3.4 确证试验 7.3.4.1 概述 从计数的乙酰胺琼脂（5.3）平板上至少挑取 5 个（少于 5 个则全部挑取）典型或可疑菌落，做 如下确证试验。 7.3.4.2 染色镜检 挑取乙酰胺琼脂（5.3）平板上单个菌落，涂片，革兰氏染色液（5.4）染色，显微镜（4.13）下 观察其菌落形态。铜绿假单胞菌显微镜下为革兰氏阴性菌，细长且长短不一，有时呈球杆状或线状， 成对或短链状排列。 7.3.4.3 氧化酶试验 取一张洁净滤纸放在灭菌玻璃平皿（4.9）内，用微量移液器（4.7）吸取氧化酶试剂（5.5
17、）滴加 一滴于滤纸上，仅使滤纸湿润，不可过湿，用接种环（4.12）挑取乙酰胺琼脂（5.3）平板上单个菌落 涂在滤纸片上，在 10 s 内出现蓝色或蓝紫色者为阳性反应，不变色为阴性反应，铜绿假单胞菌氧化 酶试验呈阳性反应。也可购买商品化氧化酶试剂或氧化酶试纸并按其说明书进行试验。 7.3.4.4 硝酸盐还原产气试验 挑取乙酰胺琼脂（5.3）平板上菌落，接种在硝酸盐蛋白胨水培养基（5.6）中，36 1 培 养 24 h2 h，观察结果，硝酸盐蛋白胨水培养基（5.6）内的小倒管中有气体者，即为阳性，否则为 阴性。铜绿假单胞菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气，因此铜绿假单胞菌硝酸盐还原产气 试验
18、阳性。 7.3.4.5 42 生长试验 挑取乙酰胺琼脂（5.3）平板上菌落，划线接种在营养琼脂（5.7）培养基制成的斜面上，42 1 培养 48 h2 h，铜绿假单胞菌能 42 生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。 如选择全自动微生物生化鉴定系统（4.14），可挑取乙酰胺琼脂（5.3）平板上可疑菌落接种营养 琼脂（5.7）平板 36 1 培养 20 h2 h 进行纯化，挑取纯化后的菌落制成一定浓度的菌悬液， 使用全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 7.3.5 结果计算 7.3.5.1 只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计在 20 CFU 200 CFU 之间，计数该稀释 度两
19、个平板上合计的典型或可疑菌落。 7.3.5.2 最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计小于 20 CFU，计数该稀释度两个平板上合计 的典型或可疑菌落。 7.3.5.3 所有稀释度平板上的菌落数合计均大于 200 CFU 且有典型或可疑菌落，应计数最高稀释度 两个平板上合计的典型或可疑菌落。 以上典型或可疑菌落确证后按式（1）计算： （1） 式中： T样品中铜绿假单胞菌菌落数； 以正式出版文本为准 6 SN/T 4656.72020 k 根据样品制备方法得出的系数，按 6.2 制备样品，k=2 ；按 6.1、6.3 制备样品，k=1 ； A某一稀释度 2 个平板典型菌落合计数； B某一稀释度
20、确证试验阳性的菌落数； C某一实验中用于确证试验的菌落数； d 稀释因子。 7.3.5.4 两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数合计均在 20 CFU 200 CFU 之间，则这两个连续 稀释度平板上的典型或可疑菌落都应计数；菌落确证后按式（2）计算。 （2） 式中： T 样品中铜绿假单胞菌菌落数； k 根据样品制备方法得出的系数，按 6.2 制备样品，k=2 ；按 6.1、6.3 制备样品，k=1 ； A 1 第一稀释度（低倍稀释度）2 个平板典型或可疑菌落合计数； B 1 第一稀释度（低倍稀释度）确证试验阳性的菌落数； C 1 某一实验中第一稀释度（低倍稀释度）用于确证试验的菌落数； A
21、2 第二稀释度（高倍稀释度）2 个平板典型或可疑菌落合计数； B 2 第二稀释度（高倍稀释度）确证试验阳性的菌落数； C 2 某一实验中第二稀释度（高倍稀释度）用于确证试验的菌落数； d 稀释因子（第一稀释度）。 7.3.5.5 所有稀释度的平板上都没有典型或可疑菌落，则直接以小于 1 乘以最低稀释倍数报告结果。 7.3.6 示例 一个稀释度计数结果在合适范围内情况举例参见 B.1 示例 1，两个稀释度计数结果都在合适范围 内情况参见 B.2。 7.4 结果报告 根据乙酰胺琼脂（5.3）平板上典型或可疑菌落验证结果，按照 7.3.5 中公式计算，报告每 cm 2 、 每 g 或每 100 cm
22、 2 样品铜绿假单胞菌数，以 CFU / cm 2 、CFU / g 或 CFU / 100 cm 2 表示。如 T 值为 0， 则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告；如 T 值小于 100 CFU，以实际数值报告；如 T 值大于或等于 100 CFU时，报告时数值按GB / T 8170规则进行修约，用10的指数形式来表示，数值保留两位有效数字。 8 方法二 铜绿假单胞菌环介导恒温扩增（LAMP）法 8.1 原理 根据铜绿假单胞菌特有的 ETA 保守序列，设计一组 LAMP 特异性引物，利用 DNA 聚合酶启动循 环链置换反应，在等温条件 (65 左右 ) 下保温 30 min 60 min
23、特异、高效、快速的完成核酸扩增。 扩增后的产物形成白色沉淀，通过对比观察或通过浊度仪生成的浊度曲线判定结果。 8.2 检验程序 检验程序见图 2。 以正式出版文本为准 7 SN/T 4656.72020 图 2 铜绿假单胞菌 LAMP 法检验程序 8.3 操作步骤 8.3.1 样品增菌 将按 6.1、 6.2 或 6.3 制备好的 SCDLP 液体培养基增菌液放入 36 1 恒温培养箱（ 4.11）中 ， 增菌培养 20 h2 h。 8.3.2 DNA 模板的制备 取 1 mL SCDLP 液体培养基增菌液放入 1.5 mL 灭菌 离心 管（ 4.15）内，置高速冷冻离心机（ 4.16） 内
24、10 000 r / min 离心 5 min，吸弃上清；加入 1 mL 灭菌双蒸水（ 5.21）混匀，高速冷冻离心机（ 4.14） 内 10 000 r / min 离心 5 min，吸弃上清；然后加灭菌双蒸水（ 5.8）100 L 混匀，置 100 煮沸 5 min， 高速冷冻离心机（ 4.16）内 10 000 r / min 离心 2 min，取上清作为 DNA 模板，可 -20 存放备用。 也可使用等效的商品化 DNA 提取试剂盒并按其说明操作。 8.3.3 DNA 扩增反应 8.3.3.1 扩增准备 根据样本数量设定所需要的 LAMP 反应管（ 4.17）数 n(n=1 管空白对照
25、 +1 管阴性对照 +1 管阳性 对照 + 样本数 )。取出 n 个 LAMP 反应管（ 4.17）。扩增反应体系见表 1，按表 1 计算各试剂的使用量， 按表 1 的顺序加入灭菌离心管（ 4.15）内，颠倒混匀， 2 000 r / min 离心 10 s。 以正式出版文本为准 8 SN/T 4656.72020 表 1 反应体系 LAMP 试剂 1 管试验用量 n 管试验用量 10LAMP 扩增缓冲液（5.9） 2.5 L n2.5 L F3 / B3（5.10） 各 1.0 L 各 n1.0 L FIP / BIP（5.10） 各 1.0 L 各 n1.0 L LoopF / LoopB
26、（5.10） 各 1.0 L 各 n1.0 L 100 mmol / L MgSO 4 （5.11） 1.75 L n1.75 L 10 mmol / L dNTP 混合物（5.12） 3.5 L n3.5 L 8 U / L Bst DNA 聚合酶（5.13） 1.0 L n1.0 L 灭菌双蒸水 （5.8） 8.25 L n8.25 L 总体积 23 L n23 L 注： 引物终浓度 F3 和 B3 为 0.2 mol / L，FIP 和 BIP 为 1.6 mol / L，LoopF 和 LoopB 为 0.4 mol / L ；Mg 2+ 终浓 度为 9 mmol / L ；dNTP
27、终浓度 1.4 mmol / L。 8.3.3.2 空白对照、阴性对照、阳性对照 每次实验应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 空白对照：以水代替 DNA 模板。 阴性对照：以水代替样品按 8.3.2 提取模板 DNA 作为 LAMP 反应的模板。 阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株（ 5.15）增菌后按 8.3.2 提取模板 DNA 作为 LAMP 反应的模板。 8.3.3.3 加样 将 8.3.2 制备好的 DNA 模板、空白对照、阴性对照、阳性对照各取 2 L 加入 8.3.3.1 准备好的的 反应管中，使反应体系达到 25 L。盖紧管盖，混匀，2 000 r / min 离心 10 s。
28、8.3.3.4 扩增 将 8.3.3.3 反应管置水浴锅（ 4.18）或 LAMP 实时浊度仪 ( 4.19) 中，65 扩增 40 min。 8.4 结果观察 8.4.1 可视化观察结果 反应结束后取出反应管，将反应管置黑色背景下观察。先观察对照反应管，阳性对照有白色沉 淀，阴性对照无白色沉淀；如果沉淀现象不明显，在反应管中加入 1 000SYBR Green I 染料（ 5.14） 2 L，轻轻混匀，立即观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。空白对照、阴性对照、阳性对照成 立，才能判定样品的检测结果。样品反应管的任何程度沉淀或加染料后的不同于阴性的颜色变化都判 定为阳性结果。 8.4.2
29、浊度仪结果 反应结束后，观察 LAMP 实时浊度仪生成的扩增曲线，空白对照、阴性对照无扩增曲线，反应 浊度值小于 0.1，阳性对照有典型扩增曲线且反应浊度值大于 0.1，否则实验视为无效。样品反应浊度 值小于 0.1 时，可判定该样品结果为阴性；样品反应浊度值大于或等于 0.1 时，可判定该样品结果为 阳性。 以正式出版文本为准 9 SN/T 4656.72020 8.5 结果报告 根据 8.4 铜绿假单胞菌初筛检测结果，如果初筛结果为阴性，可直接报告样品中未检出铜绿假单 胞菌；如果初筛结果为阳性，则将 8.3.1 中培养后的 SCDLP 液体培养基增菌液划线接种乙酰胺琼脂 （ 5.3）平板分
30、离菌落，将分离后的典型或可疑菌落按 7.3.4 进行确认，报告样品中检出或未检出铜绿 假单胞菌。 9 防止污染和废弃物处理的措施 应符合 SN / T 4656.8 的规定。 以正式出版文本为准 10 SN/T 4656.72020 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按SN / T 1538.1 和SN / T 1538.2制备培养基并进行性能测试，如使用等效商品化脱水合成培养基， 使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 无菌生理盐水 A.2.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.2.2 制法 称取 8.5 g 氯化钠溶于 1
31、000 mL 蒸馏水中，121 高压灭菌 15 min。 A.3 SCDLP 液体培养基 A.3.1 成分 酪蛋白胨 17.0 g 大豆蛋白胨 3.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 卵磷脂 1.0 g 吐温 80 7.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.3.3 制法 准确称取上述成分混合加入 1 000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节 pH 至 7.20.2，分装，121 高压灭菌 20 min。 A.4 乙酰胺培养基 A.4.1 成分 以正式出版文本为准 11 SN/T 4656.72020 乙酰胺 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 1.3
32、9 g 磷酸二氢钾 0.73 g 硫酸镁 (MgSO 4 .7H 2 O) 0.5 g 酚红 0.012 g 琼脂 20.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.4.3 制法 准确称取除琼脂和酚红外上述成分，加到 1 000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节 pH 至 7.20.2， 加入琼脂、酚红，121 高压灭菌 20 min，制成平板备用。 A.5 革兰氏染色液 A.5.1 结晶紫染色液 A.5.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 乙醇 c（C 2 H 5 OH）=95% 20 mL 草酸铵水溶液（10 g / L） 80 mL A.5.1.3 制法 将结晶紫溶于乙醇 c（C 2 H 5 OH
33、 ）=95% 中，然后与草酸铵溶液混合。 注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性。结晶紫溶液放 置过久会产生沉淀，不能再用。 A.5.2 革兰氏碘液 A.5.2.1 成分 碘片 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.5.2.2 制法 将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加入其余的蒸 馏水。 以正式出版文本为准 12 SN/T 4656.72020 A.5.3 脱色剂 乙醇 c（C 2 H 5 OH ）=95% A.5.4 沙黄复染液 A.5.4.1 成分 沙黄 0.25 g 乙醇 c（C 2 H 5 OH）=95
34、% 10 mL 蒸馏水 90 mL A.5.4.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中 , 待完全溶解后加入蒸馏水。 注 : 如无沙黄 , 可用苯酚复红染色液 (1+10) 替代 , 作为复染液 , 复染时间为 10 s。 A.5.5 染色法 A.5.5.1 将培养 10 h 24 h 的培养物涂片。 A.5.5.2 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1 min 水洗。 A.5.5.3 滴加革兰氏碘液，作用 1 min，水洗。 A.5.5.4 滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约 30 s，水洗。 A.5.5.5 滴加复染剂，复染 1 min，待干，镜检；呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者
35、为革兰氏 阴性菌。 A.6 氧化酶试剂 A.6.1 成分 盐酸四甲基对苯二胺 1.0 g 灭菌蒸馏水 100 mL A.6.2 制法 准确称取 1.0 g 盐酸四甲基对苯二胺倒入装有 100 mL 灭菌蒸馏水的褐色瓶中，溶解后放冰箱中可 保存 2 周。 A.7 硝酸盐蛋白陈水培养基 A.7.1 成分 蛋白胨 l0.0 g 酵母浸膏 3.0 g 硝酸钾 2.0 g 亚硝酸钠 0.5 g 蒸馏水 l000 mL 以正式出版文本为准 13 SN/T 4656.72020 A.7.2 制法 准确称取蛋白胨和酵母浸膏，加到 l000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节 pH 至 7.20.2，加入硝 酸钾和
36、亚硝酸钠，溶解混匀，分装到内有倒立小玻璃产气管的 20 mm200 mm 试管中，每管 10 mL， 115 高压灭菌 20 min，备用。 A.8 营养琼脂 A.8.1 成分 蛋白陈 10.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 l000 mL A.8.2 制法 除琼脂外，将其余成分溶解于燕馏水中，调节 pH7.20.2，加入琼脂，加热溶解，分装到 20 mm200 mm 试管中，每管 10 mL，121 高压灭菌 15 min，放置成斜面备用。 以正式出版文本为准 14 SN/T 4656.72020 附 录 B （资料性附录） 示例 B.1 示例 1
37、只计数一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数时，计数结果见表 B.1。 表 B.1 计数结果 稀释度 1:10 稀释度（第一稀释度） 1:100 稀释度（第二稀释度） 典型或可疑菌落数 80,88 5,7 用于确证试验的菌落数 5 确证试验阳性的菌落数 4 则 A=80+88=84, B=4，C=5 按 6.1 制备样品， k=1 T = 1684 510 -1 = 1.310 3 CFU / g 按 6.2 制备样品， k=2 T = 2 1684 510 -1 = 2.610 3 CFU / cm 2 按 6.3 制备样品， k=1 T = 1684 510 -1 = 1.310 3 CFU
38、 / 100 cm 2 B.2 示例 2 两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数均在合适计数范围内时，计数结果见表 B.2。 表 B.2 计数结果 稀释度 1:10 稀释度（第一稀释度） 1100 稀释度（第二稀释度） 典型或可疑菌落数 89,92 13,12 用于确证试验的菌落数 5 5 确证试验阳性的菌落数 4 3 则 A1=89+92=181, B1=4,C1=5, A2=13+12=25 , B2=3,C2=5 按 6.1 制备样品， k=1 T = 1814 / 5+25310 / 5 210 = -1 CFU / g 以正式出版文本为准 SN/T 4656.72020 按 6.2 制
39、备样品， k=2 T = 2 1814 / 5+25310 / 5 210 = -1 CFU / cm 2 按 6.3 制备样品， k=1 T = 1814 / 5+25310 / 5 210 = -1 CFU / 100 cm 2 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1.25 字数 31 千字 2020 年 10 月第一版 2020 年 10 月第一次印刷 印数 1500 书号：155175136 定价 18.00 元 进出口纺织品生物安全检验方法 第 7 部分 铜绿假单胞菌 行 业 标 准 SN/T 4656.72020 * * * SN/T 4656.7 20 20 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242 -7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
