1、ICS 11.020 C 50 DB61 陕西省地方标准 DB 61/ T 1001.32015 保健用品微生物限度检查 第 3 部分： 铜绿假单胞菌检验 Microbial limit examination for healthcare supplies Part 3: Tests for pseudomonas aeruginosa 2015 - 12 - 29 发布 2016 - 03 - 01 实施 陕西省质量技术监督局 发布 DB61/T 1001.32015 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引 用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 设
2、备和材料 . . 1 5 培养基和试剂 . . 2 6 操作步骤 . . 4 7 判定和报告 . . 5 表 1 铜绿假单胞菌菌落形态特征 . 4 DB61/T 1001.32015 前 言 DB61/T 1001保健用品微生物限度检查分为以下5个部分： 第1部分：总则； 第2部分：菌落总数测定； 第3部分：铜绿假单胞菌检验； 第4部分：金黄色葡萄球菌检验； 第5部分：霉菌和酵母菌数测定。 本部分为DB61/T 1001的第3部分。 DB61/T 998保健用品安全性评价指导原则及试验方法与D B61/T 999保健用品功能学评价指导 原则及试验要求、DB61/T 1000保健用品产品标准编写
3、规范、DB61/T 1001保健用品微生物限度 检查共同构成了陕西省保健用品系列地方标准。 下面列出了这些地方标准的结构： a) DB61/T 998保健用品安全性评价指导原则及试验方法分为以下 6 个部分： 1) 第 1 部分：安全性评价指导原则； 2) 第 2 部分：皮肤急性毒性试验； 3) 第 3 部分：皮肤长期毒性试验； 4) 第 4 部分：皮肤刺激性试验； 5) 第 5 部分：皮肤过敏性试验； 6) 第 6 部分：眼部刺激性试验。 b) DB61/T 999保健用品功能学评价指导原则及试验要求分为以下 16 个部分： 1) 第 1 部分：总则； 2) 第 2 部分：改善微循环类功能学
4、评价动物试验； 3) 第 3 部分：改善微循环类功能学评价人体试验； 4) 第 4 部分：乳房保健类功能学评价动物试验； 5) 第 5 部分：乳房保健类功能学评价人体试验； 6) 第 6 部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价动物试验； 7) 第 7 部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价人体试验； 8) 第 8 部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价动物试验； 9) 第 9 部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价人体试验； 10) 第 10 部分：皮肤瘙痒类功能学评价动物试验； 11) 第 11 部分：皮肤瘙痒类功能学评价人体试验； 12) 第 12 部分：妇女卫生保健类功能学评价动物试验； 1
5、3) 第 13 部分：妇女卫生保健类功能学评价人体试验； 14) 第 14 部分：眼部保健类功能学评价人体试验； 15) 第 15 部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价动物试验； 16) 第 16 部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价人体试验。 c) DB61/T 1000保健用品产品标准编写规范分为以下 8 个部分： 1) 第 1 部分：总则； 2) 第 2 部分：保健贴类产品标准编写规范； DB61/T 1001.32015 III 3) 第 3 部分：眼贴类产品标准编写规范； 4) 第 4 部分：含药芯类产品标准编写规范； 5) 第 5 部分：喷涂类产品标准编写规范； 6) 第
6、6 部分：清洗液类产品标准编写规范； 7) 第 7 部分：器具类产品标准编写规范； 8) 第 8 部分：功能服装类产品标准编写规范。 本部分根据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本部分由陕西省食品药品监督管理局提出并归口。 本部分起草单位：陕西省食品药品监督管理局、陕西省质量技术监督局。 本部分主要起草人：杨晓莉、乔蓉霞、李伟、张扬。 本部分由陕西省食品药品监督管理局负责解释。 本部分首次发布。 联系信息如下： 单位：陕西省食品药品监督管理局 电话：029-62288000 地址：西安市高新六路56号 邮编：710065 DB61/T 1001.32015 1 保健用品微生物限度检查
7、 第 3 部分：铜绿假单胞菌检验 1 范围 DB61/T 1001的本部分规定了保健用品中铜绿假单胞菌的检验方法。 本部分适用于陕西省保健用品中铜绿假单胞菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB61/T 1001.1-2015 保健用品微生物限度检查 第1部分：总则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 铜绿假单胞菌 pseudomona s aeruginosa 铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，
8、能产生绿脓菌素。此外还能液化明 胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在 421条件下能生长。该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败 血症等病变。 4 设备和材料 进行铜绿假单胞菌检验应具备以下设备和材料，并应符合其要求： a) 恒温培养箱：温度应控制在 42 1、36 1； b) 冰箱：温度应控制在 04； c) 高压灭菌锅； d) 显微镜：10 100 ； e) 电子天平：感量为 0.1g； f) 电磁炉； g) 振荡器或均质器； h) 灭菌吸管：1mL（具 0.01mL 刻度）、10 mL（具 0.1mL 刻度）； i) 试管：10 mm 100 mm、18 mm 180 mm； j) 丝口瓶或锥形
9、瓶：容量为 300mL、500mL； k) 培养皿：直径为 90mm； l) 接种环和接种针； m) 载玻片； n) pH 计或精密 pH 试纸。 DB61/T 1001.32015 5 培养基和试剂 5.1 无菌生理盐水 无菌生理盐水应符合DB61/T 1001.1-2 015中3.6.3规定的要求。 5.2 SCDLP 液体培养基制备 应先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其他成份混合，加热溶解，冷却至25 1，调 节pH值至7.27.3，121灭菌20min。注意振荡，使沉淀于底层的聚山梨酯80与其他成份充分混合，冷 却至25左右使用。各制备材料的种类和量应符合以下规定的要求（其中，
10、无酪蛋白胨和大豆蛋白胨时 也可用多胨代替）： a) 酪蛋白胨：17g； b) 大豆蛋白胨：3g； c) 氯化钠：5g； d) 磷酸氢二钾：2.5g； e) 葡萄糖：2.5g； f) 卵磷脂：1g； g) 聚山梨酯 80：7g； h) 蒸馏水：1000mL。 5.3 十六烷基三甲基溴化铵培养基制备 5.3.1 十六烷基三甲基溴化铵培养基制备材料的种类和量应符合以下要求： a) 牛肉膏：3g； b) 十六烷基三甲基溴化铵：0.3g； c) 蛋白胨：10g； d) 琼脂：20g； e) 氯化钠：5g； f) 蒸馏水：1000mL。 5.3.2 十六烷基三甲基溴化铵培养基的制备方法应为：将除琼脂以外的
11、上述成份混合加热溶解，冷却 至 25 1，调节 pH 值至 7.47.6，加入琼脂，115灭菌 20min 后，制成平板备用。 5.4 乙酰胺培养基制备 5.4.1 乙酰胺培养基制备材料的种类和量应符合以下要求： a) 乙酰胺：10.0g； b) 硫酸镁（MgSO 4.7H2O）：0.5g； c) 氯化钠 ：5.0g； d) 酚红：0.012g； e) 无水磷酸氢二钾：1.39g； f) 琼脂：20g； g) 无水磷酸二氢钾：0.73g； h) 蒸馏水：1000mL。 5.4.2 乙酰胺培养基的制备方法应为：将除琼脂和酚红以外的其他成份加入蒸馏水中，加热溶解，冷 却至 25 1，调节 pH 值
12、至 7.2，加入琼脂、酚红，121灭菌 20min 后，制成平板备用。 DB61/T 1001.32015 3 5.5 绿脓菌素测定用培养基制备 5.5.1 绿脓菌素测定用培养基制备材料的种类和量应符合以下要求： a) 蛋白胨：20g； b) 琼脂：18g； c) 氯化镁：1.4g； d) 甘油（化学纯）：10g； e) 硫酸钾：10g； f) 蒸馏水：1000mL。 5.5.2 绿脓菌素测定用培养基的制备方法应为：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加入蒸馏水中，加温使其 溶解，冷却至 25 1，调节 pH 值至 7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115灭菌 20min 后，制成斜面备用。
13、 5.6 明胶培养基制备 5.6.1 明胶培养基制备材料的种类和量应符合以下要求： a) 牛肉膏：3g； b) 明胶：120g； c) 蛋白胨：5g； d) 蒸馏水：1000mL。 5.6.2 明胶培养基的制备方法应为：取各成份加入蒸馏水中浸泡 20min，随时搅拌加温使其溶解，冷 却至 25 1，调节 pH 值至 7.4，分装于试管内，115灭菌 20min 后，直立制成高层备用。 5.7 硝酸盐蛋白胨水培养基制备 5.7.1 硝酸盐蛋白胨水培养基制备材料的种类和量应符合以下要求： a) 蛋白胨：10g； b) 亚硝酸钠：0.5g； c) 酵母浸膏：3g； d) 硝酸钾：2g； e) 蒸馏水
14、：1000mL。 5.7.2 硝酸盐蛋白胨水培养基的制备方法应为：将蛋白胨和酵母浸膏加入蒸馏水中，加热使其溶解， 冷却至 25 1，调节 pH 值至 7.2，煮沸过滤后，补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分 装到加有小倒管的试管中，115灭菌 20min 后备用。 5.8 普通琼脂斜面培养基制备 5.8.1 普通琼脂斜面培养基制备材料的种类和量应符合以下要求： a) 蛋白胨：10g； b) 牛肉膏：3g； c) 氯化钠：5g； d) 琼脂：15g； e) 蒸馏水：1000mL。 DB61/T 1001.32015 5.8.2 普通琼脂斜面培养基的制备方法应为：将除琼脂以外的其他成份加入
15、蒸馏水中，加热使其溶解， 冷却至 25 1，调节 pH 值至 7.27.4，加入琼脂，加热溶解，分装到试管中，115高压灭菌 20min 后，制成斜面备用。 6 操作步骤 6.1 样品的处理 应按照DB61/T 1001. 1-2015中4.4的规定制备1:10样品匀液。 6.2 增菌和分离培养 6.2.1 应取 10mL 的 1:10 样品匀液加到 90mL 的 SCDLP 液体培养基中，在 36 1条件下培养 18h 24h。若有铜绿假单胞菌生长，则培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。 6.2.2 应从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，在 3
16、6 1条 件下培养 18h24h； 在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时， 也可划线接种于乙酰胺培养基平板上， 在 36 1条件下培养 24h 2h。铜绿假单胞菌在不同培养基上的菌落形态特征见表 1： 表 1 铜绿假单胞菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 十六烷三甲基溴化铵琼脂 菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常 扩散有水溶性色素。 乙酰胺培养基 菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色。 6.3 染色镜检 应挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检结果应为革兰氏阴性杆菌。 6.4 氧化酶试验 应取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取可疑菌落涂
17、在滤纸片上，然后在 其上滴加一滴新配制的1二甲基对苯二胺试液；在15s 30s之内，若出现粉红色或紫红色，则为氧化 酶试验阳性；若培养物不变色，则为氧化酶试验阴性。 6.5 绿脓菌素试验 应挑取可疑菌落2个3个，分别接种在绿脓菌 素测定培养基上，置于36 1培养24h2h，加 入氯仿3mL5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液 内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将 氯仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后， 静置片刻。若上层盐酸液内出现粉红色到紫 红色时，则试验结果为阳性；否则为阴性。 6.6 硝酸盐还原产气试验 应挑取可疑菌落的纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，
18、在361条件下培养24h2h，观察 结果。若在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体，则试验结果为阳性；若小导管中未产生气体，则试 验结果为阴性。 DB61/T 1001.32015 5 6.7 明胶液化试验 应挑取可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，在361 条件下培养24h2h，取出放 冰箱10min30min。若明胶培养物呈溶解状或表面溶解，则 试验结果为阳性；若明胶 培养物凝固不溶， 则试验结果为阴性。 6.8 42生长试验 应挑取可疑菌落的纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，在421条件下培养24h48h。若 培养基上有菌落生长，则试验结果为阳性；若培养基上无菌落生长，则试验结果为阴性。 7 判定和报告 7.1 结果判定 若被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌、氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性，则应 判定样品中检出铜绿假单胞菌；若绿脓菌素试验为阴性，而明胶液化、硝酸盐还原产气和42生长试验 皆为阳性，则仍应判定样品中检出铜绿假单胞菌。 7.2 结果报告 应在报告中指出，在每1g、1mL或10cm 2 样品中检出或未检出铜绿假单胞菌。 _
