1、ICS 11.020 C 50 DB61 陕西省地方标准 DB 61/ T 1001.42015 保健用品微生物限度检查 第 4 部分： 金黄色葡萄球菌检验 Microbial limit examination for healthcare supplies Part4: Tests for staphylococcus aureus 2015 - 12 - 29 发布 2016 - 03 - 01 实施 陕西省质量技术监督局 发布 DB61/ T 1001.42015 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引 用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 设
2、备和材料 . . 1 5 培养基和试剂 . . 2 6 操作步骤 . . 3 7 判定和报告 . . 4 表 1 金黄色葡萄球菌菌落形态特征 . 3 DB61/ T 1001.42015 II 前 言 DB61/T 1001保健用品微生物限度检查分为以下5个部分： 第1部分：总则； 第2部分：菌落总数测定； 第3部分：铜绿假单胞菌检验； 第4部分：金黄色葡萄球菌检验； 第5部分：霉菌和酵母菌数测定。 本部分为DB61/T 1001的第4部分。 DB61/T 998保健用品安全性评价指导原则及试验方法与D B61/T 999保健用品功能学评价指导 原则及试验要求、DB61/T 1000保健用品产
3、品标准编写规范、DB61/T 1001保健用品微生物限度 检查共同构成了陕西省保健用品系列地方标准。 下面列出了这些地方标准的结构： a) DB61/T 998保健用品安全性评价指导原则及试验方法分为以下 6 个部分： 1) 第 1 部分：安全性评价指导原则； 2) 第 2 部分：皮肤急性毒性试验； 3) 第 3 部分：皮肤长期毒性试验； 4) 第 4 部分：皮肤刺激性试验； 5) 第 5 部分：皮肤过敏性试验； 6) 第 6 部分：眼部刺激性试验。 b) DB61/T 999保健用品功能学评价指导原则及试验要求分为以下 16 个部分： 1) 第 1 部分：总则； 2) 第 2 部分：改善微循
4、环类功能学评价动物试验； 3) 第 3 部分：改善微循环类功能学评价人体试验； 4) 第 4 部分：乳房保健类功能学评价动物试验； 5) 第 5 部分：乳房保健类功能学评价人体试验； 6) 第 6 部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价动物试验； 7) 第 7 部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价人体试验； 8) 第 8 部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价动物试验； 9) 第 9 部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价人体试验； 10) 第 10 部分：皮肤瘙痒类功能学评价动物试验； 11) 第 11 部分：皮肤瘙痒类功能学评价人体试验； 12) 第 12 部分：妇女卫生保健类功能学评价动物
5、试验； 13) 第 13 部分：妇女卫生保健类功能学评价人体试验； 14) 第 14 部分：眼部保健类功能学评价人体试验； 15) 第 15 部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价动物试验； 16) 第 16 部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价人体试验。 c) DB61/T 1000保健用品产品标准编写规范分为以下 8 个部分： 1) 第 1 部分：总则； DB61/ T 1001.42015 III 2) 第 2 部分：保健贴类产品标准编写规范； 3) 第 3 部分：眼贴类产品标准编写规范； 4) 第 4 部分：含药芯类产品标准编写规范； 5) 第 5 部分：喷涂类产品标准编写规范；
6、 6) 第 6 部分：清洗液类产品标准编写规范； 7) 第 7 部分：器具类产品标准编写规范； 8) 第 8 部分：功能服装类产品标准编写规范。 本部分根据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本部分由陕西省食品药品监督管理局提出并归口。 本部分起草单位：陕西省食品药品监督管理局、陕西省质量技术监督局。 本部分主要起草人：杨晓莉、乔蓉霞、李伟、张扬。 本部分由陕西省食品药品监督管理局负责解释。 本部分首次发布。 联系信息如下： 单位：陕西省食品药品监督管理局 电话：029-62288000 地址：西安市高新六路56号 邮编：710065 DB61/ T 1001.42015 1 保健用品
7、微生物限度检查 第 4 部分：金黄色葡萄球菌检验 1 范围 DB61/T 1001的本部分规定了保健用品中金黄色葡萄球菌的检验方法。 本部分适用于陕西省保健用品中金黄色葡萄球菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB61/T 1001.1-2015 保健用品微生物限度检查 第 1 部分：总则 DB61/T 1001.3-2015 保健用品微生物限度检查 第 3 部分：铜绿假单胞菌检验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1
8、金黄色葡萄球菌 staphyloco ccus aureus 金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳 性。该菌是葡萄球菌中对人类致病力最强的一种，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症。 4 设备和材料 对保健用品进行金黄色葡萄球菌检验时应具备以下设备和材料，并应符合其规定： a) 恒温培养箱：温度应控制在 42 1、36 1； b) 恒温水浴箱：温度应控制在 36 1； c) 冰箱：温度应控制在 04； d) 高压灭菌锅； e) 显微镜：10100； f) 电子天平：感量为 0.1g； g) 电磁炉； h) 振荡器或均质器； i) 灭菌吸
9、管：容量为 1mL（具 0.01mL 刻度）、10 mL（具 0.1mL 刻度）； j) 试管：10 mm100 mm、18 mm180 mm； k) 丝口瓶或锥形瓶：容量为 300mL、500mL； l) 培养皿：直径为 90mm； m) 接种环和接种针； n) 载玻片； DB61/ T 1001.42015 2 o) pH 计或精密 pH 试纸。 5 培养基和试剂 5.1 无菌生理盐水 无菌生理盐水应符合DB61/T 1001.1-2 015中3.6.3规定的要求。 5.2 SCDLP 液体培养基 SCDLP液体培养基应符合DB61/T 10 01.3-2015中5.2规定的要求。 5.3
10、 7.5氯化钠肉汤制备 5.3.1 7.5氯化钠肉汤制备材料的种类和量应符合以下要求： a) 蛋白胨：10g； b) 牛肉膏：3g； c) 氯化钠：75g； d) 蒸馏水：1000mL。 5.3.2 7.5氯化钠肉汤的制备方法应为： 将上述成份加热溶解， 冷却至 251， 调节 pH 值至 7.4， 分装，121灭菌 20min 后，冷却至 25左右使用。 5.4 Baird-Parker 平板制备 5.4.1 Baird-Parker 平板制备材料的种类和量应符合以下要求： a) 胰蛋白胨：10g； b) 牛肉膏：5g； c) 酵母浸膏：1g； d) 丙酮酸钠：10g； e) 甘氨酸：12g
11、； f) 氯化锂（LiCl 6H2O）：5g； g) 琼脂：20g； h) 蒸馏水：950mL。 5.4.2 应按照以下步骤制备 Baird-Parker 平板： a) 首先，应将 50mL 的 30%卵黄盐水与 10mL 的 1%亚碲酸钾溶液混合，制得卵黄亚碲酸钾增菌剂， 并将其保存于冰箱内； b) 然后，将 5.4.1 中的各成份加入蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至 251，调节 pH 值至 7.0 0.2。分装为每瓶 95mL，121灭菌 15min。 临用时加热溶化，冷却至 50，每 95mL 加入 5mL 卵黄亚碲酸钾增菌剂，摇匀后制成平板备用。使用前在冰箱贮存不得超过 48h。
12、 5.5 血琼脂培养基制备 应取100mL营养琼脂、10mL脱纤维羊血（或兔血），将灭菌后的营养琼脂加热融化，冷却至50左 右以无菌操作加入脱纤维羊血（或兔血），摇匀，制成平板备用。 5.6 甘露醇发酵培养基制备 DB61/ T 1001.42015 3 5.6.1 甘露醇发酵培养基制备材料的种类和量应符合以下要求： a) 蛋白胨：10g； b) 氯化钠：5g； c) 牛肉膏：5g； d) 甘露醇：10g； e) 0.2麝香草酚蓝溶液：12mL； f) 蒸馏水：1000mL。 5.6.2 甘露醇发酵培养基的制备方法应为：将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，冷 却至 251，调节 p
13、H 值至 7.4，加入甘露醇和指示剂，混匀后分装于试管内，115灭菌 20min 后 备用。 5.7 兔（人）血浆制备 应取一定量3.8柠檬酸钠溶液，经121高压灭菌15min后，加入4倍体积的兔（人）全血，混匀静 置（或以3000r/min离心30min）使其血液细胞下降，即可得兔（人）血浆。 6 操作步骤 6.1 样品的处理 应按照DB61/T 1001. 1-2015中4.4的规定制备1:10样品匀液。 6.2 增菌和分离培养 6.2.1 应取 1:10 样品匀液 10mL 接种到 90mLSCDLP 液体培养基或 7.5氯化钠肉汤中，在 36 1条件 下培养 24h 2h。 6.2.2
14、 挑取上述培养物分别划线接种于血琼脂平板和 Baird-Parker 平板，其中：血琼脂平板应在 36 1条件下培养 18h24h，Baird-Parker 平板应在 36 1条件下培养 18h24h 或 45h48h。金黄色 葡萄球菌在不同培养基上的菌落形态特征见表 1： 表 1 金黄色葡萄球菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 Baird-Parker 平板 菌落直径为 2mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一浑浊带，在其外层有一透 明圈。用接种针接触菌落有似奶油树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无 混浊带及透明圈。 血琼脂平板 菌落较大、圆形、光滑凸起、湿润、金黄
15、色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。 6.3 鉴定 6.3.1 染色镜检 应挑取可疑菌落，进行革兰染色。镜检结果应为革兰阳性 菌，排列成葡萄球状，无芽胞，无荚膜， 直径约为0.5 m1 m。 DB61/ T 1001.42015 4 6.3.2 甘露醇发酵试验 应挑取可疑菌落纯培养物接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面加入2mm3mm的灭菌液体石 蜡，在36 1条件下培养24h 2h。若能发酵甘露醇产酸，则应判定试验结果为阳性；否则试验结果 为阴性。 6.4 血浆凝固酶试验 应挑取可疑菌落接种于营养肉汤中，在36 1条件下培养18h24h。 吸取新鲜配置兔（人）血浆， 放入灭菌小试管中，加入可疑菌落的肉汤培养物0.5mL。混匀，置于36 1恒温培养或恒温水浴，每 半小时观察一次，连续观察6小时。 若呈现凝固或大于1/2的体积凝固，则应判定试验结果为阳性,否则 为阴性。并应以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物 分别作为阳性和阴性对照。 7 判定和报告 7.1 结果判定 若在上述选择平板上有可疑菌落生长， 经染色镜检， 证明为革兰阳性葡萄球菌， 且甘露醇发酵试验、 血浆凝固酶试验结果均为阳性，则应判定样品检出金黄色葡萄球菌。 7.2 结果报告 应在检验报告中指出在1g、1mL或10cm 2 样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。 _
