1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5228.8 2019 出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS 法 第 8 部分：肺炎克雷伯氏菌 Rapid detection of pathogens in export food-MALDI-TOF MS method- Part 8: Klebsiella pneumoniae 2019-12-27 发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5228.8 2019 I 前 言 SN/T 52282
2、019出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS 法分为 9 个部分： 第 1 部分：溶藻弧菌； 第 2 部分：产气荚膜梭菌； 第 3 部分：金黄色葡萄球菌； 第 4 部分：克罗诺杆菌属； 第 5 部分：创伤弧菌； 第 6 部分：蜡样芽胞杆菌； 第 7 部分：空肠弯曲菌； 第 8 部分：肺炎克雷伯氏菌； 第 9 部分：铜绿假单胞菌。 本部分为 SN/T 52282019 的第 8 部分。 本部分按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国北京海关。 本部分主要起草人：李可、方
3、莹、沈飚、陆金虎、曾静、汪琦。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5228.8 2019 出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI -TOF MS 法 第 8 部分：肺炎克雷伯氏菌 1范围 SN/T 5228 的本部分规定了出口食品中肺炎克雷伯氏菌的 MALDI -TOF MS 快速筛选方法。 本部分适用于出口食品中肺炎克雷伯氏菌的快速筛选。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 G
4、B/T 14926.13 实验动物 肺炎克雷伯杆菌检测方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BTS ：细菌检测标准品（bacterial test standard）。 CHCA ： - 氰基 -4- 羟基肉桂酸（ -cyano-4-hydroxy-cinnamic acid）。 MALDI-TOF MS ：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix -assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry）。 4生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具
5、备资格的工作人员检测肺炎克雷伯氏菌，所有培养物和废 弃物应参照 GB 19489 中的有关规定执行。 5方法提要 MALDI-TOF MS 是应用于微生物全细胞快速检测的技术，主要依据微生物特征蛋白指纹图谱分析， 完成微生物的鉴定和分类。将待鉴定的菌落样品与适量的基质溶液点加在样品板上，溶剂挥发后形成 样品与基质的共结晶，利用激光作为能量来源辐射共结晶体，基质分子吸收能量与样品解吸附并使样 品电离，经过飞行时间分析器，将不同质荷比的离子分开，形成微生物特异性的质谱图。将待测微生 物质谱图与已知微生物的标准蛋白指纹图谱数据库进行比较，可以确定微生物的种属，进行微生物种 属鉴定。 6试剂和材料 除
6、有特殊说明外，所有试剂均使用色谱纯试剂。实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5228.8 2019 6.1 血琼脂平板。 6.2 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录 A 第 A.1 章。 6.3 胆硫乳琼脂（DHL）：见附录 A 第 A.2 章。 6.4 乙腈（ACN）。 6.5 无水乙醇。 6.6 甲酸。 6.7 三氟乙酸（TFA）。 6.8 CHCA。 6.9 BTS 标准品。 6.10 溶剂 I：按照水 : 乙腈（6.4） : 三氟乙酸（6.7）为 50 : 47.5 : 2.5（体积比）的比例配制，现配 现用。 6.11BTS 标准溶液的配
7、制：用 50 nullL 溶剂 I（6.10）溶解 BTS 标准品（6.9）。用移液器反复吹吸溶解 BTS 粉末（避免剧烈振荡），室温放置 5 min，再次溶解，待 BTS（6.9）全部溶解后，瞬时离心，用 200 nullL PCR 管进行分装，每管 5 nullL，-20保存备用。 6.12CHCA 基质溶液的配制：在 CHCA（6.8）粉末中加入溶剂 I（6.10），使 CHCA 终浓度为 10 mg/mL。 振荡混匀，直至溶液澄清。用 1.5 mL 离心管进行分装，每管 50 nullL，用封口膜密封管口，室温放置备用。 放置后，如出现大量沉淀应弃用。 7主要仪器和设备 7.1 台式离
8、心机：最大离心力 16 000 g。 7.2 涡旋振荡器。 7.3 微量可调移液器和灭菌吸头：2 nullL，100 nullL，200 nullL，1 000 nullL。 7.4 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。 8检测步骤 8.1 检测流程图 食品中肺炎克雷伯氏菌 MALDI -TOF MS 检测流程见图 1。 图 1 肺炎克雷伯氏菌 MALDI -TOF MS 检测流程图 以正式出版文本为准 3 SN/T 5228.8 2019 8.2 样品制备、增菌培养 称取 25 g 样品至盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯内，8 000 r/min10 000 r/min 均质 1 m
9、in2 min， 或放入盛有 225 mL BPW 无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min。若样品为液态，吸取 25 mL 样品至盛有 225 mL BPW 的无菌锥形瓶 ( 瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。于 36 1 培养 18 h24 h。 8.3 分离 将增菌后的培养物，划线接种于 DHL（6.3）平板上，于 36 1培养 18 h24 h，观察各个平 板上生长的菌落形态。 在 DHL（6.3）平板上肺炎克雷伯氏菌菌落呈淡粉红色，大而隆起，光滑湿润， 粘液状，相邻菌落容易融合成脓汁样，接种针挑取菌落时呈丝状粘连。 8.4 可疑菌落的处理 可选用直接涂抹法或
10、甲酸提取法任一方法进行可疑菌落处理。如果直接涂抹得不到高质量的图 谱，应继续选用甲酸提取法处理可疑菌落。 8.4.1 直接涂抹法 用牙签或 10 nullL 枪头从选择性平板直接挑取可疑菌落，涂抹在靶板上，形成一均匀薄层（越薄越 好）。覆盖 1 L CHCA 基质溶液（6.12），待 CHCA 基质溶液（6.12）干燥后进行 MALDI -TOF MS 检测。 8.4.2 甲酸提取法 8.4.2.1 接种培养 至少应挑取 5 个可疑菌落，划线接种血琼脂平板（6.1），36 1培养 18 h24 h。如果平板上 的可疑菌落少于 5 个，则应全部挑取。 8.4.2.2 菌落蛋白提取 8.4.2.2
11、.1 取适量细菌培养物（5 mg10 mg），将细菌细胞重悬于 300 nullL 水中，充分混匀；加入 900 nullL 无水乙醇（6.5），涡旋振荡混匀；13 000 g，离心 2 min，弃上清，相同条件瞬时离心 30 s，用移液器移 除剩余上清液，室温放置 5 min，使乙醇挥发。 8.4.2.2.2 加入 30 nullL50 nullL 70 % 甲酸（6.6）（甲酸的量可以根据细菌沉淀的量进行调整），充分混匀， 加入等体积乙腈（6.4），涡旋振荡混匀；13 000 g，离心 2 min，上清液用于点样。 8.5 点样 取 1 L 8.4.2.2.2 中制备的上清液点到靶板上，同
12、时在靶板上点 BTS 标准品（6.9），置室温，待 液滴干燥后，在样品上覆盖1 L CHCA 基质溶液（6.12），待 CHCA 基质溶液（6.12）干燥后进行 MALDI-TOF MS 检测。 8.6 MALDI-TOF MS 检测 8.6.1 仪器参数的设置 选择线性操作模式，正离子模式；检测范围：2 000 Da20 000 Da；激光点击数：每图谱 40 次（6 次激光累积）；激光频率：60.0 Hz ；离子源加速电压：20 kV。 8.6.2 仪器校正 对可疑菌落进行质谱数据采集前，应先使用 BTS 标准品（6.9）对仪器的质荷比进行校准，确保 以正式出版文本为准 4 SN/T 52
13、28.8 2019 质荷比误差范围小于 0.030 0%。 8.6.3 数据采集及分析 对可疑菌落进行质谱数据采集并保存，通过 Biotyper 软件进行分析鉴定。 8.6.4 结果判定标准 MALDI-TOF MS 鉴定结果给出数据库中与鉴定菌种最为匹配的 10 个菌株种属，并给出相对应的 匹配分值。分值在 2.3003.000 之间，表示菌种鉴定的可信度很高；在 2.0002.299 之间，表示可信的 菌属鉴定和可能的菌种鉴定；在 1.7001.999 之间，表示可能的菌属鉴定；在 0.0001.699 之间，表示 不可信的鉴定结果。 9结果判定及报告 9.1可疑菌落经 MALDI -TO
14、F MS 鉴定为肺炎克雷伯氏菌，且匹配分值大于等于 1.700，可判定检测结 果为阳性可疑，应按照 GB/T 14926.13 方法做进一步确证和报告。 9.2 除 9.1 以外的结果，可判定检测结果为阴性，报告未检出肺炎克雷伯氏菌。 10废弃物处理和防污染措施 检测过程中的废弃物需经 121高压灭菌处理至少 30 min 后再弃置。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5228.8 2019 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1缓冲蛋白胨水（BPW） A.1.1成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠 3.5 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.
15、1.2制法 将 A.1.1 成分加热溶解，于 25 时调节 pH 值至 7.20.2，分装于 500 mL 广口瓶中，每瓶 225 mL， 121 高压灭菌 15 min。 A.2胆硫乳琼脂（DHL） A.2.1成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 3.0 g 乳糖 10.0 g 蔗糖 10.0 g 牛胆盐 1.0 g 硫代硫酸钠 2.2 g 柠檬酸钠 1.0 g 柠檬酸铁铵 1.0 g 中性红 0.03 g 或 5 g/L 水溶液 6 mL 琼脂 18.0 g20.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.2.2制法 除中性红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，搅拌均匀，静置约 10
16、 min，加热煮沸至 完全溶解。调节 pH 值为 7.30.1，再将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，搅拌均匀，静置约 10 min，加 热煮沸至完全溶解。将两种溶液混合后，再加入 5 g /L 中性红水溶液 6 mL，搅拌均匀，待冷却至 50 55，倾注平皿备用。 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 12 千字 2020 年 1 月第一版 2020 年 1 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517568 定价 16.00 元 出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS 法 第 8 部分：肺炎克雷伯氏菌 行 业 标 准 SN/T 5228.82019 SN/T 5228.82019 * * * 网址 SN/T 5228.8 2019
