1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5228.9 2019 出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS 法 第 9 部分：铜绿假单胞菌 Rapid detection of pathogens in export food-MALDI-TOF MS method- Part 9: Pseudomonas aeruginosa 2019-12-27 发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5228.9 2019 I 前 言 SN/T 52282
2、019出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS 法分为 9 个部分： 第 1 部分：溶藻弧菌； 第 2 部分：产气荚膜梭菌； 第 3 部分：金黄色葡萄球菌； 第 4 部分：克罗诺杆菌属； 第 5 部分：创伤弧菌； 第 6 部分：蜡样芽胞杆菌； 第 7 部分：空肠弯曲菌； 第 8 部分：肺炎克雷伯氏菌； 第 9 部分：铜绿假单胞菌。 本部分为 SN/T 52282019 的第 9 部分。 本部分按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国伊宁海关、中华人民共和国库尔 勒海关、
3、中华人民共和国吉林海关、中华人民共和国北京海关。 本部分主要起草人：王娉、孟茹、冯新忠、赵晓羙、陈颖、蔡阳、曾静。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5228.9 2019 出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS 法 第 9 部分：铜绿假单胞菌 1范围 SN/T 5228 的本部分规定了出口食品中铜绿假单胞菌的 MALDI -TOF MS 快速筛选方法。 本部分适用于出口食品中铜绿假单胞菌的快速筛选。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的
4、修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 化妆品安全技术规范 微生物检验方法 铜绿假单胞菌检验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BTS ：细菌检测标准品（bacterial test standard）。 CHCA ： - 氰基 -4- 羟基肉桂酸（ -cyano-4-hydroxy-cinnamic acid）。 MALDI-TOF MS ：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix -assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spe
5、ctrometry）。 4生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测铜绿假单胞菌，所有培养物和废弃 物应参照 GB 19489 中的有关规定执行。 5方法提要 MALDI-TOF MS 是应用于微生物全细胞快速检测的技术，主要依据微生物特征蛋白指纹图谱分析， 完成微生物的鉴定和分类。将待鉴定的菌落样品与适量的基质溶液点加在样品板上，溶剂挥发后形成 样品与基质的共结晶，利用激光作为能量来源辐射共结晶体，基质分子吸收能量与样品解吸附并使样 品电离，经过飞行时间分析器，将不同质荷比的离子分开，形成微生物特异性的质谱图。将待测微生 物质谱图与已知微生物的标准蛋白指纹图谱数据库进
6、行比较，可以确定微生物的种属，进行微生物种 属鉴定。 6试剂和材料 除有特殊说明外，所有试剂均使用色谱纯试剂。实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5228.9 2019 6.1 脑心浸液琼脂（Brain Heart Infusion Agar, BHIA）。 6.2 SCDLP 液体培养基：参见化妆品安全技术规范。 6.3 十六烷基三甲基溴化铵培养基参见化妆品安全技术规范。 6.4 乙腈（acetonitrile，ACN）。 6.5 无水乙醇。 6.6 甲酸。 6.7 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）。 6.8 CH
7、CA。 6.9 BTS 标准品。 6.10 溶剂 I：按照水 : 乙腈（6.4）: 三氟乙酸（6.7）为 50: 47.5: 2.5（体积比）的比例配制，现配 现用。 6.11BTS 标准溶液的配制：用 50 nullL 溶剂 I（6.10）溶解 BTS 标准品（6.9）。用移液器反复吹吸溶解 BTS 粉末（避免剧烈振荡），室温放置 5 min，再次溶解，待 BTS（6.9）全部溶解后，瞬时离心，用 200 nullL PCR 管进行分装，每管 5 nullL，-20保存备用。 6.12CHCA 基质溶液的配制：在 CHCA（6.8）粉末中加入溶剂 I（6.10），使 CHCA 终浓度为 10
8、 mg/mL。 振荡混匀，直至溶液澄清。用 1.5 mL 离心管进行分装，每管 50 nullL，用封口膜密封管口，室温放置备用。 放置后，如出现大量沉淀应弃用。 7主要仪器和设备 7.1 台式离心机：最大离心力 16 000 g。 7.2 涡旋振荡器。 7.3 微量可调移液器和灭菌吸头：2 nullL，100 nullL，200 nullL，1 000 nullL。 7.4 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。 8检测步骤 8.1 检测流程图 食品中铜绿假单胞菌 MALDI -TOF MS 检测流程见图 1。 图 1 铜绿假单胞菌 MALDI -TOF MS 方法检测流程图 以正式出版文本为
9、准 3 SN/T 5228.9 2019 8.2 样品制备、增菌培养 称取 25 g 样品至盛有 225 mL SCDLP 的无菌均质杯内，8 000 r/min10 000 r/min 均质 1 min2 min， 或放入盛有 225 mL SCDLP 无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min。若样品为液态，吸取 25 mL 样品至盛有 225 mL SCDLP 的无菌锥形瓶 ( 瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。于 36 1 培养 18 h24 h。 8.3 分离 将增菌后的培养物，划线接种于十六烷基三甲基溴化铵培养基（6.3）上，于 36 1培养 18 h24
10、h。铜绿假单胞菌在十六烷基三甲基溴化铵培养基（6.3）上菌落扁平无定型，向周边扩散或略有 蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。 8.4 可疑菌落的处理 8.4.1 接种培养 至少应挑取 5 个可疑菌落，划线接种 BHIA（6.1）培养基上，30 1培养 18 h24 h。如果平 板上的可疑菌落少于 5 个，则应全部挑取。 8.4.2 菌落蛋白提取 8.4.2.1 取适量细菌培养物（5 mg10 mg），将细菌细胞重悬于 300 nullL 水中，充分混匀；加入 900 nullL 无水乙醇（6.5），涡旋振荡混匀；13 000 g，离心 2 min，弃上清，相同条件
11、瞬时离心 30 s，用移液器 移除剩余上清液，室温放置 5 min，使乙醇挥发。 8.4.2.2 加入 30 nullL50 nullL 70 % 甲酸（6.6）（甲酸的量可以根据细菌沉淀的量进行调整），充分混匀， 加入等体积乙腈（6.4），涡旋振荡混匀；13 000 g，离心 2 min，上清液用于点样。 8.5 点样 取 1 L 8.4.2.2 中制备的上清液点到靶板上，同时在靶板上点 BTS 标准品（6.9），置室温，待 液滴干燥后，在样品上覆盖 1 L CHCA 基质溶液（6.12），待 CHCA 基质溶液（6.12）干燥后进行 MALDI-TOF MS 检测。 8.6 MALDI-T
12、OF MS 检测 8.6.1 仪器参数的设置 选择线性操作模式，正离子模式；检测范围：2 000 Da20 000 Da；激光点击数：每图谱 40 次（6 次激光累积）；激光频率：60.0 Hz ；离子源加速电压：20 kV。 8.6.2 仪器校正 对可疑菌落进行质谱数据采集前，应先使用 BTS 标准品（6.9）对仪器的质荷比进行校准，确保 质荷比误差范围小于 0.030 0%。 8.6.3 数据采集及分析 对可疑菌落进行质谱数据采集并保存，通过 Biotyper 软件进行分析鉴定。 8.6.4 结果判定标准 MALDI-TOF MS 鉴定结果给出数据库中与鉴定菌种最为匹配的 10 个菌株种属
13、，并给出相对应的 以正式出版文本为准 4 SN/T 5228.9 2019 匹配分值。分值在 2.3003.000 之间，表示菌种鉴定的可信度很高；在 2.0002.299 之间，表示可信的 菌属鉴定和可能的菌种鉴定；在 1.7001.999 之间，表示可能的菌属鉴定；在 0.0001.699 之间，表示 不可信的鉴定结果。 9结果判定与报告 9.1可疑菌落经 MALDI -TOF MS 鉴定为铜绿假单胞菌，且匹配分值大于等于 1.700，可判定检测结果 为阳性可疑，应按照化妆品安全技术规范微生物检验方法 铜绿假单胞菌检验做进一步确证和 报告。 9.2除 9.1 以外的结果，可判定检测结果为阴
14、性，报告未检出铜绿假单胞菌。 10废弃物处理和防污染措施 检测过程中的废弃物需经 121高压灭菌处理至少 30 min 后再弃置。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 8801230 1/16 印张 0.5 字数 10 千字 2020 年 1 月第一版 2020 年 1 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517569 定价 14.00 元 出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS 法 第 9 部分：铜绿假单胞菌 行 业 标 准 SN/T 5228.92019 SN/T 5228.92019 * * * 网址 SN/T 5228.9 2019
