1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3306.16 2021 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 11. 020 CCS C 62 2021-06-18发布 2022-01-01实施 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法第16部分：寨卡病毒 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port Part16: Zika Virus 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 3306.16 2021 前 言 本部分按照GB/T 1.12020标准化工作
2、导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的 规定起草。 本文件是SN/T 3306国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法的第16部分。SN/T 3306已 经发布了以下部分： 第1部分：鼠疫杆菌； 第2部分：产毒素霍乱弧菌； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：嗜肺军团菌； 第5部分：布鲁氏菌； 第6部分：黄热病毒； 第7部分：猴痘病毒； 第8部分：基孔肯雅病毒； 第9部分：结核分枝杆菌； 第10部分：炭疽芽孢杆菌； 第11部分：副溶血性弧菌； 第12部分：空肠弯曲菌； 第13部分：疟原虫； 第14部分：大肠杆菌O157:H7； 第15部分：沙门氏菌； 第16部分：寨卡病毒。 第17部分：包虫
3、。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：烟台国际旅行卫生保健中心、天津国际旅行卫生保健中心、中国科学检验检 疫科学研究院、甘肃国际旅行卫生保健中心、北京蓝谱生物科技有限公司。 本文件主要起草人：钟响、刘宁、高娟娟、左锋、韩辉、刘鹏、王颖、方绍庆、王莉、米佳。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 3306.16 2021 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法第16部分：寨卡病毒 1范围 本文件规定了国境口岸寨卡病毒的环介导恒温扩增（LAMP）检测方法。 本文件适用于国
4、境口岸出入境人员血液、尿液、唾液等及埃及伊蚊、白蚊伊蚊携带寨卡病毒的 筛查检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 租用于本文件。 GB 19489实验室生物安全通用要素 SN/T 4652.2 国境口岸寨卡病毒病防控技术规范第2部分：标本采集和处理方式 SN/T 4652.3 国境口岸寨卡病毒病防控技术规范第3部分：实验室检测 病原微生物实验室生物安全管理条例（中华人民共和国国务院令第424号） 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RN
5、A：核糖核酸（ribonucleic acid） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetra acetic acid） LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification） 4生物安全措施及防污染措施 寨卡病毒在我国归属于三类病原微生物，应在生物安全二级实验室（BSL-2）开展实验室检测。 应按照病原微生物实验室生物安全管理条例等相关规定要求，做好生物安全防护
6、工作。 LAMP扩增灵敏度高使得其更容易污染导致假阳性，因此应高度重视扩增产物的污染问题，反应 过程中和反应完成后应避免开盖。加样过程应在生物安全柜进行，加样顺序为：阴性对照、样本、阳 性对照，切勿打乱顺序，否则易出现假阳性。废弃物处理应符合GB 19489中的规定。 5技术概要 根据寨卡病毒的NS5基因序列设计内、外引物及环状引物，识别靶序列上的8个独立区域，利用 Bst DNA聚合酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而 复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，同时从dNTP析出大量焦磷酸根离子。添加的 以正式出版文本为准 2 SN/T 330
7、6.16 2021 钙黄绿素显色剂初始与锰离子结合处于荧光淬灭状态，随着反应的进行，焦磷酸根离子夺去结合的锰 离子，钙黄绿素恢复从而发出绿色荧光，进而与反应液中的镁离子结合使荧光增强。 6试剂和材料 6.1引物：根据寨卡病毒特有的NS5基因（见附录A）设计一套特异性引物、包括外引物1、外引物 2、内引物1、内引物2和环状引物1、环状引物2。 外引物1（F3，5-3）：GCAGAGCAATGGATGGGATA 外引物2（B3，5-3）：CCCATCCTTGAGGTACAGCT 内引物1（FIP，5-3）：AAGAACCTGAGGGCATGTGCAAGACTCAAACGAATGGCGGT 内引物2
8、（BIP，5-3）：CACAGGAGTGGAAACCCTCGACTGAAGTGGTGGGAGCAGA 环状引物1（LF，5-3）：CACAACGCAGTCATCTCCAC 环状引物2（LB，5-3）：TGGAGCAATTGGGAAGAAGTCC 6.2核算提取试剂盒：QIAamp Viral RNA Kit 1） 或市售等效产品。 6.3Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶：均为8 U/ L。 6.4 2ThermoPol缓冲液：含40 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、20 mmol/L （NH 4 ） 2 SO 4 、20 mmol/L KCl、 16 mmol/L MgSO
9、 4 、0.2% Tween 20、1.6 mol/L甜菜碱、dNTPs每种浓度2.8 mmol/L 。 6.5钙黄绿素。 6.6阳性对照：可溯源的标准质粒，或含目的片段的RNA亦可。 6.70.2 mL和1.5 mL塑料离心管。 6.8吸头，配套移液器使用。 7仪器和设备 7.1移液器：量程0.1 L 2 L，量程0.5 L 10 L，量程10 L 100 L，量程100 L 1 000 L。 7.2高速台式离心机：7 000 g。 7.3水浴锅或加热模块：65 1 和95 1 。 7.4组织研磨器。 7.5紫外线照射装置：波长240 nm260 nm，350 nm370 nm。 7.6计时
10、器。 8检测程序 寨卡病毒检测程序见图1。 9操作步骤 9.1样本的采集、保存和运输 样本采集、保存和运输按照SN/T 4652.2确定的执行。 1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其它等效产品具有相同 的效果，则可使用这些等效产品。 以正式出版文本为准 3 SN/T 3306.16 2021 9.2模板RNA提取 从血液、尿液、唾液样本或蚊虫样本中提取RNA采用6.2所示病毒RNA提取试剂盒或采用市售等 效产品，详见试剂盒说明书。 9.3LAMP检测 9.3.1反应体系 寨卡病毒的环介导引物恒温扩增反应体系见表1. 表1寨卡病毒环介导引物恒温扩增反应体
11、系 试剂名称 储备液浓度 体系加样/ L 2ThermoPol缓冲液 12.5 F3引物 5 pmol 0.1 B3引物 5 pmol 0.1 FIP引物 40 pmol 0.8 BIP引物 40 pmol 0.8 LF引物 20 pmol 0.4 LB引物 20 pmol 0.4 Bst DNA聚合酶 8 U/L 1 AMV逆转录酶 8 U/L 1 模板 2 ddH 2 O 5.9 总体积 25 图1寨卡病毒LAMP检测程序 待测样品 模板RNA提取 样品前处理 LAMP反应 阴性 阳性 结果报告 以正式出版文本为准 4 SN/T 3306.16 2021 9.3.2反应过程 按照表1所述配
12、制反应体系，上述组份加入后，再加入1 L的钙黄绿素显色液，轻柔上下颠倒混 匀，瞬时离心10 s。盖上管盖后，置于64 恒温扩增50 min，之后于95 加热2 min以终止反应。 9.3.3设置空白对照、阴性对照、阳性对照 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 空白对照采用无菌水作为扩增模板。 阴性对照以RNA提取液代替RNA模板。 阳性对照以含靶序列的RNA作为扩增模板。 9.4结果观察 取出反应管，根据管内反应液颜色变化，判断结果。如肉眼观察不明显，可使用紫外线照射装 置，在护目镜保护下观察。 9.5结果判定 在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈黄绿色的条件下
13、： a）阳性结果：待检样品反应管液体呈黄绿色，则报告为LAMP检测阳性。 b）阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则报告为LAMP检测阴性。 c）寨卡病毒LAMP检测阳性，说明从该待测样本中检测到目的基因片段，提示可能有寨卡病毒 存在，如需确认应按照SN/T 4652.3确定的对该样本做进一步的分离或测序鉴定。 以正式出版文本为准 5 SN/T 3306.16 2021 附录A （资料性） 寨卡病毒基因靶序列 寨卡基因NS5基因序列（Accession No:KX421193.1，位置：1236 1459） GCAGAGCAATGGATGGGATAGACTCAAACGAATGGCGGTCAGT
14、GGAGATGACTGCGTTGTGAAGCC AATCGATGATAGGTTTGCACATGCCCTCAGGTTCTTGAATGACATGGGAAAAGTTAGGAAAGACACACA GGAGTGGAAACCCTCGACTGGATGGAGCAATTGGGAAGAAGTCCCGTTCTGCTCCCACCACTTCAACAA GCTGTACCTCAAGGATGGG 以正式出版文本为准 SN/T 3306.16 2021 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 16 千字 2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517573 定价 12.00 元 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP） 检测方法第 16 部分：寨卡病毒 行 业 标 准 SN/T 3306.162021 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7531 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
