1、ICS11 .020 CCSC62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3306 .17 2021 国境口岸环介导等温扩增(LAMP)检测 方法 第17部分:包虫 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port Part 17 :Hydatid 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 前 言 本文件按照GB / T 1.1 2020 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件为SN / T 3306 2021 国境口岸
2、环介导等温扩增( LAMP )检测方法的第17部分, SN / T 3306已发布以下部分。 第1部分:鼠疫杆菌; 第2部分:产毒素霍乱弧菌; 第3部分:志贺氏菌; 第4部分:嗜肺军团菌; 第5部分:布鲁氏菌; 第6部分:黄热病毒; 第7部分:猴痘病毒; 第8部分:基孔肯雅病毒; 第9部分:结核分枝杆菌; 第10部分:炭疽芽孢杆菌; 第11部分:副溶血性弧菌; 第12部分:空肠弯曲菌; 第13部分:疟原虫; 第14部分:大肠杆菌O157 : H7 ; 第15部分:沙门氏菌; 第16部分:寨卡病毒: 第17部分:包虫。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
3、本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国成都海关、中华人民共和国福州海关 本文件主要起草人:田绿波、刘杨、高国龙、黄恩炯、常晓松、辛文瀚、王俊贤。 SN/T3306.17 2021 国境口岸环介导等温扩增(LAMP)检测 方法 第17部分:包虫 1 范围 本文件规定了国境口岸检测包虫病疑似样本中包虫的环介导等温扩增( LAMP )方法。 本文件适用于国境口岸包虫的筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改
4、单)适用于 本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN / T 1193 基因检验实验室技术要求 WS / T 230 临床诊断中聚合酶链反应( PCR )技术的应用 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Bst酶: Bst DNA聚合酶(大片段) Bst DNA p ol y merase ( lar g e fra g ment ) DNA :脱氧核糖核酸( deox y ribonucleic acid ) dNTP :脱氧核苷三磷酸( deox y ribonucle
5、oside tri p hos p hate ) EDTA :乙二胺四乙酸( eth y lenediamine tetraacetic acid ) LAMP :环介导等温扩增( loo p -mediated isothermal am p lification ) Triton X-100 :聚乙二醇辛基苯基醚 5 技术概要 LAMP是一种连续、恒温、基于酶反应的核酸扩增技术。根据包虫的特异性序列基因设计特异性 内引物、外引物各一对,在特异性识别靶序列上的独立区域,利用Bst酶启动循环链置换反应。在特异 性基因序列区启动互补链合成,结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的
6、茎-环 DNA混合物。 LAMP反应过程中,从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的M g 2+结合,产生副 产物(焦磷酸镁)形成乳白色沉淀,加入显色液,即可通过肉眼观察判定结果。亦可加入显色液,通过颜 色变化观察判定结果。 1 SN/T3306.17 2021 6 生物安全和PCR防污染要求 实验室生物安全应符合GB 19489的规定。 PCR防污染措施按SN / T 1193和WS / T 230的规定 执行。 7 试剂和材料 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合GB / T 6682中一级水的要求。 7 .1 引物:根据包虫特有线粒体DNA COl的靶序列基因设计一套
7、特异性引物,包括外引物1 ,外引物 2 ,内引物1 ,内引物2 。 外引物( F3 , 5 -3 ) 1 : GGTTTGGGAATTATTTATTGCCT 外引物( B3 , 5 -3 ) 2 : CCAAATGCAGAGAAAACATCAA 内引物( FIP , 5 -3 ) 1 : GGAATCAAAAGTCAAGCACTCAAAGTGTTAGGTGGGTTGTCTGA 内引物( BIP , 5 -3 ) 2 : AGTATGTGTTTAGGGGVTGGTTAGAAAAATTACGACGAGGACA 7 .2 DNA提取液:含20 mmol / L Tris-HCl ( p H 8.0
8、)、 2 mmol / L EDTA和1.2% Triton X-100或组 织提取试剂盒。 7 .3 dNTPs :每种核苷酸浓度10 mmol / L 。 7 .4 Bst酶: 8 U / L 。 7 .5 10 ThermoPol缓冲液:含200 mmol / L Tris-HCl ( p H 8.8 )、 100 mmol / L ( NH 4 ) 2 SO 4 、 100 mmol / L KCl 、 20 mmol / L M g SO 4 、 1% Triton X-100 。 7 .6 M g SO 4溶液: 25 mmol / L 。 7 .7 甜菜碱: 5 mol / L
9、。 7 .8 显色液:浓度为1 000 SYBR Green 。 7 .9 0.2 mL和1.5 mL塑料离心管。 7 .10 吸头,配套移液器使用。 7 .11 细胞保存液 7 .12 矿物油 8 主要仪器 主要仪器设备如下: 台式高速冷冻离心机( 7 000 g以上); 水浴锅或加热模块( 65 1 和100 1 ); 微量可调移液器一套(含以下3种规格: 0.5 L10 L , 10 L100 L , 100 L1 000 L ); 计时器; -86 冰箱。 9 检测程序 包虫检测程序见图1 。 2 SN/T3306.17 2021 图1 包虫LAMP检测程序 10 样品采集与运输 10
10、 .1 样品采集 10 .1 .1 粪便标本 采集犬新鲜粪便于一次性无菌采便管内,成形便采集5 g 8 g ,放入采便管内。采便管外表贴上带 有唯一识别号码的标签,直接用于检测,或保存,或送检。 10 .1 .2 组织标本 外科手术切除包虫病人不同感染部位囊性或泡性组织标本,用生理盐水清洗5次,放入无菌容器, 加入70%以上酒精,一个宿主含多个包囊视为多个分离株。密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标 签,或保存,或送检。 10 .2 样本的运送与保存 样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。粪便应保存于-80 冷冻3天后检测,组织标本 酒精固定后常温保存。 11 实验室检验 11 .1 样品处
11、理 取黄豆大小约100 m g 200 m g的粪便标本,加入500 L的生理盐水,振荡混匀,制成20%40% 3 SN/T3306.17 2021 的悬液;或取组织标本2 g ,加入细胞保存液。 4 , 8 000 g离心2 min 。转移上清至灭菌的干净离心 管。不能立即进行检测时,样本冻存于-70 超低温冰箱备用。 11 .2 核酸提取 在11.1获得处理后样本加入100 L DNA提取液充分混匀,沸水浴10 min (误差不超过1 min )。 16 200 g离心5 min ,上清可直接用于PCR反应。也可以使用商品化的DNA提取试剂盒并按其说明 书操作。 11 .3 环介导引物等温
12、扩增 11 .3 .1 反应体系 包虫的环介导引物等温扩增反应体系见表1 。 表1 包虫环介导引物等温扩增反应体系 组分工作液浓度加样量/ L反应体系终浓度 ThermoPol缓冲液10 2.5 1 外侧上游引物( F3 ) 10 mol / L 0.5 0.2 mol / L 外侧下游引物( B3 ) 10 mol / L 0.5 0.2 mol / L 内侧上游引物( FIP ) 40 mol / L 1 1.6 mol / L 内侧下游引物( BIP ) 40 mol / L 1 1.6 mol / L dNTPs 10 mmol / L 4 1.6 mol / L 甜菜碱5 mol /
13、 L 4 0.8 mol / L 硫酸镁溶液150 mmol / L 1 6 mmol / L Bst DNA聚合酶8 U / L 0.5 0.16 U / L DNA模板 2.5 去离子水 7.5 在上述反应体系中加入1 L SYBR Green ,加入矿物油20 L 防止体系过度蒸发。 11 .3 .2 反应过程 按照表1所述配制反应体系; 65 恒温扩增60 min , 80 2 min使酶失活,反应即结束。 11 .3 .3 空白对照、阴性对照、阳性对照设置 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 空白对照采用无菌水作为扩增模板。 阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。 阳性对照
14、以包虫阳性样本核酸,或者克隆的包虫部分DNA序列(应包含扩增区域在内)做为扩增 模板。 11 .4 结果观察 取出反应管,反复颠倒反应管,轻轻混匀并在黑色背景下观察。 4 SN/T3306.17 2021 11 .5 结果判定 在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色,阳性对照反应管液体呈绿色的条件下: a ) 阳性结果:待检样品反应管液体呈绿色,该样品报告为LAMP检测初筛阳性,需使用其他方法 进行进一步的核实; b ) 阴性结果,待检样品反应管液体呈橙色,则可报告LAMP检测阴性; c ) 若与上述条件不符,则本次检测结果无效,应更换试剂按照本方法重新检测。 5 SN/T3306.17 2021 1 2 0 2 7 1 6 0 3 3 T/ N S 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 国境口岸环介导等温扩增(LAMP)检测 方法 包虫 SN / T 3306.17 2021 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号( 100023 ) 编辑部:( 010 ) 65194242-7531 网址 / book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8801230 1 / 16 印张0.75 字数16千字 2021年7月第一版 2021年7月第一次印刷 印数 1 500 * 书号: 155175 669定价14 .00元
