HJ 1190-2021 水质 灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的鉴定 生物学检测法.pdf

1、中华人民共和国国家生态环境标准 HJ 1190 2021 水质 灭菌生物指 示物（枯 草芽孢杆 菌 黑色变种 ）的鉴定 生物学检 测法 Water quality Identification of biological indicator (Bacillus subtilis var. niger) for sterilization Biological detection method 本电子版 为正式 标 准文本， 由生态 环 境部环境 标准研 究 所审校排 版。 2021-09-17 发布 2022-04-01 实施 生 态 环 境 部 发 布 HJ 1190 2021 i 目 次

2、前 言 . ii 1 适 用范 围 . 1 2 规 范性 引用 文件. 1 3 术 语和 定义 . 1 4 方 法原 理 . 2 5 试 剂和 材料 . 2 6 仪 器和 设备 . 2 7 样品 . 3 8 分 析步 骤 . 3 9 结 果与 报告 . 6 10 灵 敏性 和特 异性. 6 11 质量 保证 和质 量控 制 . 6 12 废 物处 置 . 7 附录 A （ 规范 性附 录） 培养基 和染 色液 . 8 附录 B （ 规范 性附 录） 培养基 和染 色液 使用 说明 及结果 观察 . 14 HJ 1190 2021 ii 前 言 为贯彻 中 华人 民共 和国 环境保 护法 中华

3、人民 共 和国水 污染 防治 法 ， 防 治 生态环 境污 染， 改善 生态环 境质 量， 规范 水中 灭菌生 物指 示物 （枯 草芽 孢杆菌 黑色 变种 ）的 鉴定 方法， 制定 本标 准。 本标准 规定 了鉴 定水 中灭 菌 生物 指示 物 （枯 草芽 孢 杆菌黑 色变 种 ） 的 生物 学 方法 ， 用 于微 生物 实验 室灭菌 效果 的评价 。 本标准 的附 录 A 和附 录 B 为规范 性附 录。 本标准 为首 次发 布。 本标准 由生 态环 境部 生态 环境监 测司 、法 规与 标准 司组织 制订 。 本标准 主要 起草 单位 ：上 海市环 境监 测中 心。 本标准 验证 单位 ：

4、 浙 江省 生态环 境监 测中 心、 江苏 省常州 环境 监测 中心 、 华 东师范 大学 、 上 海 市 松 江区环 境监 测站 、上 海市 长宁区 环境 监测 站和 上海 市青浦 区环 境监 测站 。 本标准 生态 环境 部 2021 年 9 月 17 日批 准。 本标准 自 2022 年 4 月 1 日 起实施 。 本标准 由生 态环 境部 解释 。 HJ 1190 2021 1 水质 灭 菌生物指 示物（ 枯草芽孢 杆菌黑 色变种） 的鉴定 生 物学检 测法 警告： 检测 人员 应采 取必 要的生 物安 全防 护措 施 （ 包括但 不仅 限于 一次 性手 套、 口 罩、 防护 服 、

5、防 护眼镜 、鞋 套等 防护 用品 ） ；检 测时 应做 好无 菌防 护，在 无菌 操作 设备 内进 行。 1 适用范围 本标准 规定 了鉴 定水 中 灭 菌生物 指示 物（ 枯草 芽孢 杆菌黑 色变 种） 的 生 物学 方法。 本标准 适用 于微 生物 实验 室灭菌 效果 的评价 。 2 规范性引用 文件 本标准 引用了 下列 文件或 其中的 条款。 凡是 注明日 期的引 用文件 ，仅 注日期 的版本 适用于 本标 准 。 凡是未 注日 期的 引用 文件 ，其最 新版 本（ 包括 所有 的修改 单） 适用 于本 标准 。 消毒 技术 规范 （ 原 卫生 部 卫法 监发 2002 282 号）

6、 3 术语和定义 下列术 语和 定义 适用 于本 标准。 3.1 枯草芽 孢杆 菌黑 色变 种 Bacillus subtilis var. niger 也称萎 缩芽 孢杆 菌（Bacillus atrophaeus ） ，在 含酪 氨 酸的培 养基 上形 成黑 色素 的革兰 氏阳 性芽 孢 杆 菌。作 为灭 菌效 果评 价试 验的指 示菌 种。 3.2 灭菌 sterilization 用物理 或化 学的 方法 杀灭 全部微 生物 ， 包括 致病 和 非致病 微生 物 、 芽 孢和 朊 病毒蛋 白 ， 使 之达 到无 菌保障 水平。 常用 的灭菌 方法有 化学试 剂灭 菌（如 环氧乙 烷、甲

7、 醛 等 ） 、射 线 灭菌（ 如 射 线、 电子 束 辐射 等 ） 、 湿热 灭菌 、干 热 灭菌和 过滤 除菌 等。 3.3 生物指 示物 biological indicator 含有对 特定 灭菌 过程 具有 一定耐 受力 的活 微生 物的 生物制 品。 注 ：生物指示物为特定灭菌过 程是否满足杀灭指定数量微生物的必须条件提供信息， 并规定该过程的置信水平。 HJ 1190 2021 2 4 方法原理 经灭菌 处置 后含 枯草 芽孢 杆菌黑 色变 种芽 孢的 水样 通过孔 径 为 0.45 m 的滤 膜过滤 ， 细 菌和 芽孢 被 截留在 滤膜 上， 然后 将滤 膜置于 酪氨 酸琼 脂

8、培 养基 上，36 1 培 养 72 h 96 h ， 枯草 芽孢 杆菌 黑 色变种 产生 的酪 氨酸 酶可 分解并 利用 酪氨 酸形 成黑 色素， 产生 黑色 的特 征菌 落。 对 特征 菌落 进 行 染 色 镜 检后通 过生 化试 验做 进一 步鉴定 ， 能利 用甘 油 和 甘 露糖 ， 可 还原 硝酸 盐 和 水 解淀粉 ， 不能 利用 苦杏 仁 苷 和 甘露 醇， 并确 认为 革兰 氏阳性 芽孢 杆菌 的特 征菌 落为枯 草芽 孢杆 菌黑 色变 种，鉴 定结 果为 阳性 。 5 试剂和材料 除非另 有说 明， 分析 时均 使用符 合国 家标 准的 分析 纯试剂 ，实 验用 水为 蒸馏

9、水 。 5.1 酪氨酸琼脂 培养 基， 见附 录 A.1 。 5.2 营养琼脂培 养基 ，见 附录 A.2 。 5.3 淀粉培养基 和碘 液， 见附 录 A.3 。 5.4 硝酸盐还原 培养 基和 相关试 剂， 见附 录 A.4 。 5.5 甘油复红肉 汤培 养基 ，见附 录 A.5 。 5.6 甘露糖生化 培养 基， 见附 录 A.6 。 5.7 甘露醇生化 培养 基， 见附 录 A.6。 5.8 苦杏仁苷生 化培 养基 ，见附 录 A.7 。 5.9 革兰氏染色 液， 见附 录 A.8 。 5.10 芽孢染色 液， 见附 录 A.9 。 5.11 阴性对 照菌 ：如 地 衣芽孢 杆菌 （B

10、acillus licheniformis ） 。 5.12 阳性对照 菌： 枯草 芽孢杆 菌黑 色变 种（Bacillus subtilis var. niger ） 。 5.13 枯草芽孢 杆菌 黑色 变种 芽 孢悬 液 ： 按照 消 毒技术 规范 2.1.1.2.3 （2 ） 的规 定制备 ， 也可 购 买 浓 度范围 在 10 6 CFU/ml 10 9 CFU/ml 之间的市售 枯 草芽 孢杆菌 黑色 变种 芽孢 悬液 。 5.14 无菌滤膜 ：直 径 50 mm ，孔径 0.45 m 的醋酸 纤维滤 膜。 按 无菌 操作 要求 包扎 ， 经 121 高压 蒸汽 灭 菌 20 min

11、 ，晾干 备用 ；或 将滤 膜 放入烧 杯中 ，加 入实 验用水 ，煮 沸灭 菌 3 次，15 min/ 次，前 2 次 煮沸 后需 换水洗 涤 2 3 次。 也可 采 用市售 的无 菌滤 膜。 5.15 石蜡质封 口膜 。 5.16 无菌水： 取适 量实 验用水 ， 经 121 高 压蒸 汽灭 菌 20 min，备 用。 注 1 ：5.1 5.10 的成分及制备 方法见附录 A ，也可使用市售 商品化 培养基或染色液 ； 注 2 ：5.11 5.12 ，建议购买由 国内或国际菌种保藏机构保藏的遗传学特性得到确认和保证并可追溯的标准菌株。 6 仪器和设备 6.1 样品瓶：螺 口带 盖或 磨口

12、具 塞的 250 ml 、500 ml 广口玻璃 瓶。 6.2 恒温培养箱 ：36 1 。 6.3 高压蒸汽灭 菌器 ：121 ， 可调 。 6.4 pH 计： 准确 到 0.1 pH 单 位或 更高 精度 。也 可 使用 pH 精密 试纸 。 6.5 显微镜：物镜 4 或 5 、10 、20 、40 ， 油镜 100， 目镜 10 或 15 。 6.6 分析天平： 实际 分度 值 0.0001 g 。 6.7 培养皿：直 径 90 mm 。 HJ 1190 2021 3 6.8 过滤装置： 配有 砂芯 滤器、 圆筒 形 玻 璃漏 斗 和 真空泵 ，抽 滤压 力不 低于-50 kPa 。 6.

13、9 接种环：直径 1 mm 3 mm。 6.10 镊子：不 锈钢 或一 次性无 菌塑 料镊 子 。 6.11 刻度移 液管 ：1 ml 、10 ml 。 也可使 用可 调式 移 液器。 6.12 量筒：100 ml 。 6.13 锥形瓶：100 ml 。 6.14 酒精灯。 6.15 试管：10 ml 。 6.16 无菌操作 设备 ：无 菌室 、 超净 工作 台、 生物 安全柜 。 6.17 一般实验 室 常 用仪 器和设备 。 注： 试验前， 移液管、 样品瓶 、 培养皿、 锥形瓶 、 试管 、 砂 芯滤器、 圆筒形玻 璃漏斗等 玻 璃器皿应按无 菌操作要 求 包扎，高压蒸汽灭菌器（6.3

14、）中 121 灭菌 20 min ，烘干，备用。也可采用干热灭菌 （135 140 灭 菌 3 h 5 h ， 或 160 170 灭菌 2 h 4 h ，或 180 200 灭 菌 0.5 h 1 h ）。 7 样品 7.1 样品采集 7.1.1 评价使用 高 温高 压 灭菌设 备的 灭菌 效果 时， 取样品 瓶 （6.1 ） ， 加 入枯 草 芽孢杆 菌黑 色变 种芽 孢悬 液 （5.13 ） 及 200 ml 无菌水 （5.16 ） 使混 合液 中 枯 草芽 孢杆菌 黑色 变种 芽孢 终浓 度达 到 510 4 CFU/ml 5 10 5 CFU/ml 。 灭菌处 置 完毕后 ， 取 出

15、样 品瓶 ， 对 水 样进行 灭菌 生物 指示 物 （ 枯草芽 孢杆 菌黑 色变 种） 的检测 。 7.1.2 评价 使 用其 它 灭 菌 设备的 灭菌 效果 时， 灭菌 前取适 量枯 草芽 孢杆 菌黑 色变种 芽孢 悬液 （5.13） 加 入灭菌 设备 ， 使 水样 中 枯 草芽孢 杆菌 黑色 变种 芽孢 终浓度 达 到 5 10 4 CFU/ml 510 5 CFU/ml 。 灭菌处 置完毕 后， 从灭 菌设备 中 采集 水 样 ， 进行 灭菌 生物 指示物 （枯 草芽 孢杆 菌黑 色变种 ） 的 检测 。 采 样 量 一 般为样品瓶容量的 80% 左 右， 不 得用样品洗涤样品 瓶。 样

16、品采集完毕后，迅 速用无菌包装纸 包扎样品 瓶 。 7.2 样品保存 样品采 集后 宜 在 2 h 内检 测， 否则 应在 10 以 下冷 藏保存 运输 ， 但不 得超 过 6 h 。 实验 室接 收样 品 后，不 能立 即开 展检 测的 ，样品 应 在 4 以 下冷 藏 保存， 并 在 2 h 内检 测。 注 ： 宜使用生物安全周转箱进 行 样品 周转。 8 分析步骤 8.1 方法程序 样品中 枯草 芽孢 杆菌 黑色 变种的 检测 程序 见 图 1 。 8.2 样品过滤 用无菌镊子（6.10）以无菌操作夹取无 菌滤膜（5.14 ）贴 放在已灭菌的过滤装置（6.8 ）上，固 定 好过滤 装置

17、。将 样品 充分 混匀后 取 100 ml 抽滤，以 无菌水 （5.16 ） 冲洗 滤器 内壁 2 3 次。 样品 过 滤HJ 1190 2021 6 表 1 阴性 、阳 性对 照菌 应呈现 的生 化反 应结 果 推荐菌株 特征指标 阴性对照菌 阳性对照菌 地衣芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌黑色变种 酪氨酸 琼脂 培养基 乳白色菌落 黑色菌落 革兰氏染色 芽孢染色 淀粉水解 硝酸盐还原 甘油利用 甘露糖利用 甘露醇利用 苦杏仁苷利用 注：“”表示阳性，“”表示阴性。 9 结果与报告 9.1 结果判定 符合 8.4、8.5， 可鉴 定为 枯草芽 孢杆 菌黑 色变 种， 结果判定 为 阳性 。 9.2 结

18、果评价 100 ml 样品中 检出 枯草 芽 孢杆菌 黑色 变种 ，评 价为 灭菌不 合格 ；100 ml 样品 中 未检 出枯 草芽 孢杆 菌黑色 变种 ，评 价 为 灭菌 合格 。 10 灵敏性和 特异 性 10.1 灵敏性 6 家实 验室 分别 对枯 草芽 孢杆菌 黑色 变种 芽孢 悬液 （ 以芽 孢计 ） 高 浓度 （10 6 CFU/100 ml ） 、中 浓度 （10 4 CFU/100 ml ） 、 低浓 度（10 2 CFU/100 ml ） 样品进行 方法 灵敏 性检测 ， 结果显 示枯 草芽 孢 杆 菌 黑 色 变种的 检出 率 均 为 100% 。 10.2 特异性 6

19、家 实 验室 分 别对 枯 草芽孢 杆 菌 黑色 变 种阳 性 对照组 和 地 衣芽 孢 杆菌 阴 性对照 组 进 行方 法 特异 性 检测， 结果 显示 阳性 对照 组枯草 芽孢 杆菌 黑色 变种 的检出 率 为 100% ， 阴 性对 照组中 枯草 芽孢 杆菌 黑 色 变种的 检出 率 为 0 。 11 质量保证 和质 量控 制 11.1 每批样 品均 应进 行 空白对 照试 验、 阴性 对照 试验 、 阳性 对照 试验 。 HJ 1190 2021 7 11.2 每 20 个 样品 或每 批 次样品 （20 个/ 批） 检测 一个 平 行样 ，若 平行 样 与 原样品 的 结 果不 一致

20、 时， 则 本批 次试 验无 效， 需重 新 检测 。 11.3 应使用 有证 标准 菌 株 对每 批次 培养 基进 行质量 检验 。 12 废物处置 实验产 生的 废物 经 121 高压蒸 汽灭 菌 20 min 30 min 后，依法委 托具 备相 应资质 的单 位进 行处 置。 HJ 1190 2021 8 附 录 A （规范 性附 录） 培养基 和染 色液 A.1 酪氨酸琼 脂培 养基 A.1.1 成分 胰蛋白 胨 0.5 g 葡萄糖 0.5 g 氯化钠 0.5 g 磷酸氢 二钾 0.5 g 七水合 硫酸 镁 0.5 g L- 天冬酰胺 0.5 g L- 酪氨酸 0.5 g 干酪素 0

21、.5 g 微量盐 溶液 1 ml 琼脂 20 g 蒸馏水 1000 ml 其中微 量盐 溶液 配方 ： 七水合 硫酸 亚铁 1.360 g 二水合 氯化 铜 0.027 g 六水合 氯化 钴 0.040 g 二水合 钼酸 钠 0.025 g 氯化锌 0.020 g 硼酸 2.850 g 四水合 二氯 化锰 1.800 g 酒石酸 钠 1.770 g 蒸馏水 1000 ml A.1.2 制备 方法 将除琼 脂以 外的 各成 分溶 解于蒸 馏水 中， 按配 方顺 序逐一 加入 营养 成分 ， 待 一种成 分溶 解后 加 入 另 一 种成 分， 调 节 pH 值至 7.0 左右 。加 入琼 脂， 加

22、热 煮沸， 使琼 脂融 化，121 高压 蒸汽 灭 菌 15 min 。 待冷却 至 50 55 ， 每个培 养皿 内分 别倾 注 25 ml 30 ml 培养基， 待用 。 HJ 1190 2021 9 A.2 营养琼脂 培养 基 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15 g20 g 蒸馏水 1000 ml A.2.2 制备 方法 将除琼 脂以 外的 各成 分溶 解于蒸 馏水 中 ， 调 节 pH 值至 7.2 7.4 。 加入 琼脂 ， 加 热煮沸 ， 使琼 脂 融 化， 121 高压 蒸汽 灭 菌 15 min 。 待冷却 至 50 55

23、 ， 每个 培养 皿内 分别 倾注 15 ml 25 ml 培养 基，待 用。 A.3 淀粉培养 基和 碘液 A.3.1 淀粉 培养 基 A.3.1.1 成分 蛋白胨 5.0 g10.0 g 酵母膏 1.0 g 牛肉膏 3.0 g 淀粉 2.0 g 琼脂 15 g20 g 蒸馏水 1000 ml A.3.1.2 制备 方法 将除琼 脂以 外的 各成 分溶 解于蒸 馏水 中 ， 调 节 pH 值至 7.2 7.4 。 加入 琼脂 ， 加 热煮沸 ， 使琼 脂 融 化， 121 高压 蒸汽 灭 菌 20 min。 待冷却 至 50 55 ， 每个 培养 皿内 分别 倾注 15 ml 25 ml 培

24、养 基，待 用。 A.3.2 碘液 A.3.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 ml A.3.2.2 配制 方法 将碘与 碘化 钾先 行混 合， 加入蒸 馏水 少许 充分 振摇 ，待完 全溶 解后 ，再 加蒸 馏水 至 300 ml 。 HJ 1190 2021 10 A.4 硝酸盐还 原培 养基 和 相关试 剂 A.4.1 硝酸 盐还 原培 养基 A.4.1.1 成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 硝酸钾 1.0 g 蒸馏水 1000 ml A.4.1.2 制备 方法 溶解各 成分 于蒸 馏水 中， 必要时 加热 ， 调 节 pH

25、 值至 7.0 7.6， 分装 于试管 中， 每管 分 装 4 ml 5 ml ，121 高 压蒸 汽灭 菌 15 min 20 min。 A.4.2 格里 斯氏 （Griess ）试剂 A.4.2.1 成分 A 液： 对氨基 苯磺 酸 0.5 g 稀醋酸 （10% 左 右） 150 ml B 液： - 萘胺 0.1 g 蒸馏水 20 ml 稀醋酸 （10% 左 右） 150 ml A.4.2.2 配制 方法 将对氨 基苯 磺酸 溶于 稀醋 酸中 ， 制成 A 液； 将 - 萘 胺溶于 稀醋 酸中 ，用 蒸馏 水稀释 ，制成 B 液 。 A.4.3 二苯 胺试 剂 A.4.3.1 成分 二苯胺

26、 0.5 g 浓硫酸 （98.3% ） 100 ml 蒸馏水 20 ml A.4.3.2 配制 方法 将二苯 胺溶 于浓 硫酸 中， 缓慢转 移 至 20 ml 蒸馏水 中 稀释 。 HJ 1190 2021 11 A.5 甘油复红 肉汤 培养 基 A.5.1 成分 蛋白胨 20.0 g 甘油 10 ml 无水氯 化镁 1.4 g 无水硫 酸钾 10.0 g 碱性品 红 1.0 g 蒸馏水 1000 ml A.5.2 制备 方法 取 蛋白 胨、 无水 氯 化镁 和无水 硫酸 钾加入 蒸馏 水 中 ， 微 温溶解 ， 调节 pH 值至 7.2 7.4 ， 加 入甘 油， 加热溶 解， 混匀 ，分

27、 装于 试管中， 每管 3 ml 4 ml ，121 高 压蒸 汽灭 菌 20 min。 A.6 甘露糖生 化培 养基/ 甘露醇 生化 培养 基 A.6.1 成分 磷酸氢 二铵 1.0 g 氯化钾 0.2 g 硫酸镁 0.2 g 酵母膏 0.2 g 琼脂 5 g 6 g 甘露糖/ 甘露 醇 10.0 g 蒸馏水 1000 ml 溴甲酚 紫（0.04% ） 15 ml A.6.2 制备 方法 将以上 成分 加热 溶解 ， 调节 pH 值至 7.07.2 ， 分 装 于试管 中 ， 培 养基 高度 约 4 cm 5 cm ， 112 高压蒸 汽灭 菌 30 min 。其 中 ，溴 甲酚 紫（0.0

28、4% ）配 制方法 为： 称取 0.1 g 溴 甲酚紫 ，滴 加 0.1 mol/L 氢氧化 钠溶 液 1.85 ml ， 使 之溶解 ，然 后加 蒸馏 水定 容至 250 ml 。 A.7 苦杏仁苷 生化 培养 基 A.7.1 成分 蛋白胨 5.0 g 溴甲酚 紫（1.6% ） 0.625 ml 牛肉膏 5.0 g D- 葡萄糖 0.5 g HJ 1190 2021 12 琼脂 3 g 6 g 苦杏仁 苷 0.005 g 蒸馏水 1000 ml A.7.2 制备 方法 将以上 成分 加热 溶解 ， 调节 pH 值至 6.0 6.3 ， 分 装于 试 管中， 每管 3 ml 4 ml ， 12

29、1 灭 菌 10 min。 其中， 溴甲 酚紫 （1.6% ） 配制方 法为 ：称 取 1.6 g 溴甲酚 紫， 滴加 无水 乙醇 使之溶 解， 然后 用无 水 乙 醇定容 至 100 ml 。 A.8 革兰氏染 色液 A.8.1 结晶 紫染 色液 A.8.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 95%乙醇 20 ml 1% 草酸 铵水 溶液 80 ml A.8.1.2 配制方法 将结晶 紫完 全溶 解于 乙醇 中，然 后与 草酸 铵溶 液混 合。 A.8.2 革兰 氏碘 液 A.8.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 ml A.8.2.2 配制 方法 将碘与 碘化 钾

30、先 行混 合， 加入蒸 馏水 少许 充分 振摇 ，待完 全溶 解后 ，再 加蒸 馏水 至 300 ml 。 A.8.3 沙黄 复染 液 A.8.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95%乙醇 10 ml 蒸馏水 90 ml A.8.3.2 配制 方法 将沙黄 溶解 于乙 醇中 ，然 后用蒸 馏水 稀释 。 HJ 1190 2021 13 A.9 芽孢染色 液 A.9.1 饱和 孔雀 绿水 溶液 A.9.1.1 成分 孔雀绿 7.6 g 蒸馏水 100 ml A.9.1.2 配制 方法 将孔雀 绿加 入蒸 馏水 中充 分振摇 ，待 完全 溶解 后， 再加蒸 馏水 定容 至 100 ml 。 A.9

31、.2 0.5% 番红 溶液 A.9.2.1 成分 番红 0.5 g 蒸馏水 100 ml A.9.2.2 配制 方法 将番红 加入 蒸馏 水中 充分 振摇， 待完 全溶 解后 ，再 加蒸馏 水定 容 至 100 ml 。 HJ 1190 2021 14 附 录 B （规范 性附 录） 培养基 和染 色液 使用 说明 及结果 观察 B.1 淀粉培养 基 B.1.1 操作 将待检 菌接 种于 淀粉 培养 基 （A.3.1 ） 上，36 1 培养 2 d ， 形 成明显 菌落 后， 在 平板 培养 基 上滴加 碘液 （A.3.2）。 B.1.2 结果观察 若 平板 培养 基呈 蓝黑 色， 菌落周 围

32、如 有不 变色 透明 圈，为 淀粉 水解 阳性 ； 若 平板培 养基 仍是 蓝 黑 色，为 淀粉 水解 阴性 。 B.2 硝酸盐还 原培 养基 B.2.1 操作 将 待检 菌接 种于 硝酸 盐还原 培养 基（A.4.1 ）中， 置 于 36 1 培养 1 d 5 d 。 每株 菌接种 2 管作为 平行 ，另 留 2 管不 接种作 为对 照。 取两 支干 净的空 试管 或在 白色 陶瓷 比色板 凹穴 中倒 入少 许 已 培养 1 d 5 d 的 培养 液， 再各滴 加 1 滴 A 液及 B 液（A.4.2 ）。 B.2.2 结果观察 当培养 液中 滴 加 A 液、B 液后 ， 溶 液如 变为 粉

33、红 色 、 玫 瑰红 色 、 橙 色、 棕色 等表示 有亚 硝酸 盐存 在，为 硝酸 盐还 原阳 性。 如无红 色出 现， 可滴 加 1 2 滴二 苯胺 试剂 （A.4.3 ），此 时如 呈蓝 色反 应 ， 则表示 培养 液中 仍有 硝酸 盐，且 无亚 硝酸 盐反 应， 表示无 硝酸 盐还 原作 用， 为硝酸 盐还 原阴 性；如不 呈蓝色 反应 ，表 示硝 酸盐 和形成 的亚 硝酸 盐都 已还 原成其 他物 质， 故仍 按硝 酸盐还 原阳 性处 理。 B.3 甘油复红 肉汤 培养 基 B.3.1 操作 将待检 菌接 种于 甘油 复红 肉汤培 养基 （5.5 ） 中， 于 36 1 培养 ， 观

34、察 2 d8 d 。 B.3.2 结果观察 培养液 颜色 变为 紫红 色， 表示甘 油被 细菌 分解 生成 丙酮酸 ，丙 酮酸 脱去 羧基 为乙醛 ，乙 醛与 无 色 的复红 生成 深紫 红色 的醌 式化合 物 ， 为阳 性； 否则 为阴性 。 HJ 1190 2021 15 B.4 甘露糖生 化培 养基/ 甘露醇 生化 培养 基 B.4.1 操作 将 待检 菌 分 别穿 刺接 种于 甘露糖 生化 培养 基（5.6 ） 和 甘露 醇生 化培 养基 （5.7 ），36 1 培 养 1 d 5 d 后观 察。 B.4.2 结果观察 培养后 培养 物变 黄， 表示 产酸， 为阳 性； 不变 色或 变

35、蓝（ 紫） 为阴 性。 B.5 苦杏仁苷 生化 培养 基 B.5.1 操作 将 待检 菌 穿 刺接 种于 苦杏 仁苷生 化培 养基 （5.8 ）中，36 1 培养 1 d 5 d 后观 察。 B.5.2 结果观察 培养后 培养 物 呈 黄色 者为 阳性， 呈紫 色者 为阴 性。 B.6 革兰氏染 色液 B.6.1 操作 革兰氏 染色 按照 以下 步骤 操作： a ）将 菌落 涂片 ， 在 火焰 上 固定， 用结 晶紫 染液 （A.8.1）染 色1 min，水 洗； b ）滴 加革 兰氏 碘液 （A.8.2）， 作用1 min，水洗； c ）滴加95% 乙醇 脱色 ，约15 s 30 s ， 直

36、至 染色 液被 洗掉， 不要 过分 脱色 ，水 洗； d ）滴 加沙 黄复 染液 （A.8.3）， 复染1 min，水洗、 晾干、 镜检 。 B.6.2 结果观察 镜检， 菌体 呈蓝 紫色 为 革 兰氏阳 性菌 ，呈 红色 为革 兰氏阴 性菌 。 B.7 芽孢染色 液 B.7.1 操作 芽孢染 色按 照以 下步 骤操 作： a ）将 生有 芽孢 的菌 落涂 片 ，火焰 上固 定， 用饱 和孔 雀绿水 溶液 （A.9.1）染 色10 min ，水洗； b ）滴加0.5% 番红 溶液 （A.9.2） 复染30 s ， 水洗 ， 晾 干、镜 检 。 B.7.2 结果观察 镜检， 菌 体 呈红 色 ， 芽孢 呈绿色 。