1、ICS 13.100 C 50 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.15 2021 新型冠状 病毒检测 技术规范 第 15 部分 ：血清/ 血浆 IgM 和 IgG 抗体磁 微粒化学 发光法 检 测程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 15: Serum/Plasma IgM and IgG antibodies test procedure by MCLIA 2021- 12 - 09 发布 2022 - 01 - 09 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 37
2、62.15 2021 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规 范性 引用 文件 . 1 3 术 语和 定义 . 1 4 缩 略语 . 1 5 原理 . 1 6 实 验室 生物 安全 防护 要 求 . 2 7 准备 . 2 8 样 本采 集、 要求 、保 存 和运输 . 2 9 检 测方 法 . 3 DB32/T 3762.15 2021 II 前 言 DB32/T 3762 新 型冠 状病 毒检测 技术 规范 目 前分 为以下 部分 ： 第1部 分： 生物 样本 采 集、运 输和 保存 ； 第2部 分： 病毒 分离 与 鉴定； 第3部 分： 核酸 荧光PCR 检测 程序 ； 第
3、4部 分： 重组 酶介 导 等温扩 增程 序； 第5部 分： 血清IgM 和IgG 抗体 酶联 免疫 吸附检 测 程序； 第6部 分： 血清IgM 和IgG 抗体 胶体 金免 疫层析 检 测程序 ； 第7部 分： 空气 样本 检 测与评 估； 第8部 分： 物体 表面 检 测与评 估； 第9部 分： 医务 人员 职 业暴露 检测 与评 估； 第10部 分： 微量 血清 中和试 验； 第11部 分： 全基 因组 高通量 测序 ； 第12部 分： 药物 体外 抗病毒 效果 测定 ； 第13部 分： 叠氮 溴化 丙锭- 荧光PCR 检测 程序 ； 第14部 分：N 亚基 因 组荧光PCR 检测 程序
4、 ； 第15部 分： 血清/ 血浆IgM 和IgG 抗 体磁 微粒 化学 发光法 检测 程序 ； 第16部 分： 核酸 数字PCR 法； 第17部 分： 核酸 检测 用假病 毒阳 性质 控品 ； 第18部 分： 规模 化核 酸检测 程序 。 本 文件 为DB32/T 3762 的第15部 分。 本 文件 按照GB/T 1.1-2020 标准 化工 作导 则 第1 部 分： 标 准化 文件 的结 构和 起草规 则 的规 定起 草。 本 文件 由江 苏省 卫生 健康 委员会 提出 。 本 文件 由江 苏省 卫生 标准 化技术 委员 会归 口。 本 文件 主要 起草 单位 ： 江 苏省疾 病预 防
5、控 制中 心 、 盐城市 疾病 预防 控制 中心 、 扬 州市 疾病 预防 控制 中心、 淮安 市疾 病预 防控 制中心 、南 京市 疾病 预防 控制中 心、 镇江 市疾 病预 防控制 中心 、 东 南大 学 。 本 文件 主要 起草 人： 朱立 国、 陈 国清 、 王 艳、 杨鹏 飞、 何 敏、 朱宝 立、 李楚 楚、 周璐 、 田华 、 孔筱 筱、 张 宇、 沈俐 、 韩 静、 金辉、 张诗 晗 。 DB32/T 3762.15 2021 1 新型冠状 病毒检 测 技术规范 第 15 部分： 血清/ 血浆 IgM 和 IgG 抗体磁微粒 化学发 光 法检测程 序 1 范围 本 文件 规定
6、了新 型冠 状病 毒 血清/ 血浆IgM 和IgG 抗 体 磁微粒 化学 发光 法的 检测 程序。 本文件适用于 新型 冠状病毒 确诊病例、无症 状感染者、 疑似病例、密 切接触者以及一般人群血 清/ 血浆样 本中 新冠 特异 性IgM 和IgG 抗 体磁 微粒 化学 发 光法检 测的 实验 操作 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本
7、文件。 GB 19489 实验 室生 物安 全通用 要求 WS 233 微生 物和 生物 医 学实验 室生 物安 全通 用准 则 DB32/T 3762.1 新型 冠 状 病毒检 测技 术规 范 第1部 分：生 物样 本采 集、 运输 和保存 新型冠 状病 毒实 验室 生物 安全指 南（ 第二 版） 可感染 人类 的高 致病 性病 原微生 物菌 （毒 ）种 或样 本运输 管理 规定 原 中华 人民共 和国 卫生 部 3 术语 和 定义 本文件 没有 界定 的术 语和 定义。 4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件 。 IgG ：免疫 球蛋 白G （Immunoglobulin G ） Ig
8、M ：免疫球 蛋白M （Immunoglobulin M ） MCLIA ：磁 微粒 化学发 光 法（Magnetic Chemiluminescence Enzyme Immunoassay ） RLU ：相对 发光 单位 （Relative Light Unit ） 5 原理 磁微粒化学发光 法 综合了磁微粒载体技术和 化学发光免疫检测技术。 人血清/ 血浆 中待测的新型冠 状病毒 IgM 、IgG 抗体与荧光素标记的重组 抗原结合，随后加入包被 着抗荧光素抗体的磁微粒 ，通过 抗荧光 素抗 体与 荧光 素的 特异性 结合 使抗 原抗 体复 合物连 接在 磁微 粒上 。 在 外加磁 场中
9、直接 沉 淀 ， 去 上 清后清 洗沉 淀的 复合 物 ， 加入酶 标抗 体 ， 形 成磁 微 粒抗 原 抗体 酶 标抗体 夹心 免疫 复合 物 。 再 次 清 洗后， 加入 酶促 化学 发光 底物。 底物 在碱 性磷 酸酶 作用下 被催 化裂 解， 形成 不稳定 的激 发态 中 间 体 ， 当 激发态 中间 体回 到基 态时 便发出 光子 ， 形成 发光 反 应， 通过 光量 子阅 读系 统 记录光 子能 量 ， 并 通过 计 算DB32/T 3762.15 2021 2 机处理 系统 将光 能量 强度 在标准 曲线 上 RLU 转换 为待测 抗体 的浓 度， 样本 的 RLU 与其 中的
10、新型 冠 状 病毒 IgM 、IgG 抗体 浓度 呈正相 关， 从而 检测 人血 清/ 血浆 中的 新型 冠状 病毒 IgM 、IgG 抗体 。 6 实验室 生物 安全 防护 要求 6.1 实验室 资质 及级 别 检 测 工 作 应 在 BSL-2 级 实 验 室 内 进 行 。 生 物 安 全 应 遵 照GB 19489 和WS 233 对 生 物 安 全 2 级 （BSL-2）实验室 的生 物安 全要求 。 6.2 操作人 员资 质及 防护 实验中 的个 人防 护遵 照 GB 19489 和新 型冠 状病 毒 实验室 生物 安全 指南 （第 二版） 。 6.3 废弃物 的处 理 实验室 使
11、用 过的 实验 用品 应遵照 GB 19489 对 废弃 物的处 理要 求进 行无 害化 处理。 7 准备 7.1 实验室 生物安 全防 护二 级（BSL-2 ）或以 上等 级实 验室 和相 应的配 套设 施。 7.2 仪器设 备 常用仪 器设 备如 下： 生物安 全柜 化学发 光免 疫分 析仪 离心机 移液器 高压锅 生物安 全运 输箱 水浴锅 7.3 试剂 常用试 剂如 下： 磁性颗 粒- 抗荧 光素 抗体 荧光素 标记 新型 冠状 病毒 重组抗 原 碱性磷 酸酶 标记 鼠抗 人 IgM/IgG 单克 隆抗 体 清洗液 底物液 样本稀 释液 8 样本采 集、 要求 、保存 和 运输 8.1
12、 样本采 集 DB32/T 3762.15 2021 3 血清/ 血 浆样 本按 照 DB 32/T 3762.1 中 5.3 的 要求 采 集。 8.2 样本要 求 出现严 重黄 疸、 溶血 、脂 血和微 生物 污染 的样 本， 均不可 进行 检测 。 8.3 样本保 存 血清/ 血 浆样 本可于2 8 条件 下保 存 3 d 、-20 及 以下 条件 下可 长期 保 存， 并 避免 反复 冻 融。用 于存 放样 本的 冰箱 应当专 用。 8.4 样本运 输 按照 可 感染 人类 的高 致病 性病原 微生 物菌 （毒 ）种 或样本 运输 管理 规定 、DB 32/T 3762.1 中6.1
13、、 6.2 的 要求 。 9 检测方 法 9.1 血清/血浆 IgM 抗体 磁微 粒 化学发 光法 9.1.1 试剂制 备 将新型 冠状 病毒 阴阳 性对 照和底 物液 在室 温 18 25 下平衡30 min 。 用纯 水将 清洗 液稀 释 到 工作浓 度 。 若清 洗液 有结 晶，可 将清 洗液 置于 室温 或 37 待 结晶 溶解 后再 进行稀 释。 9.1.2 磁微粒 化学 发光 法反 应体 系 和反 应程 序 取 1 mL 样本稀释液 ， 加 入 20 样本 （至 少 15 ） ， 用漩涡混 匀仪 混匀 5 s ， 静止 15 min 后 开始实 验。 根据 实验 需要 ， 如质 量
14、控 制， 设置 阴性 、 阳性 对照 各 2 管 及处 理 后样本 若干 。 分 别加 入 50 磁性颗粒- 抗荧光 素 抗 体 、75 处理后 样本 或 阴性对 照/ 阳 性对 照、50 荧光素标记 新型 冠状 病 毒重组 抗原 、75 碱性 磷 酸酶标 记鼠 抗人 IgM 单 克隆抗 体 。 反应 时间 35 min ；完成 第二 次清 洗后 每 管加入 底物 液 200 ，避光检测 ，反 应 5 s 读数 。 磁微粒 化学 发光 法反 应体 系的总 体积 可根 据不 同 厂 家、型 号的 化学 发光 仪做 相应调 整。 9.1.3 结果分析 根据 RLU 自动 计算 Cutoff 值，样
15、 本检 测的 结果 以 S/CO 值 进行 判定 ： a) 阴性（ ） ：S/CO 1.000 ，待 检样 本未 检出 新型 冠状病 毒 IgM 抗体 ； b) 阳性（ ） ：S/CO 1.000 ，待 检样 本检 出新 型冠 状病毒 IgM 抗 体。 9.1.4 质量控 制 根据 不同厂家、 型号的化学发 光仪和配套 试剂的要求， 阳性、阴性 对照S/CO 应在 规定的范围 内。 以上要 求不 符合 ，应 重新 进行试 验， 重新 进行 的试 验应从 试剂 制备 开始 。 9.1.5 结果表 述 当质量 控制 符合 要求 ： a) S/CO 1.000 ，结 果表 述 为 待 检样 本未 检
16、出 新型 冠 状病 毒IgM 抗体 。 b) S/CO 1.000 ，结 果表 述 为 待 检样 本检 出新 型冠 状 病毒 IgM 抗体 。 DB32/T 3762.15 2021 4 9.2 血清/血浆 IgG 抗体 磁 微粒 化学发 光法 9.2.1 试剂制 备 将新型 冠状 病毒 阴阳 性对 照和底 物液 在室 温 18 25 下平 衡30 min 。用纯水将 清洗 液稀 释 到 工作浓 度 。 若清 洗液 有结 晶，可 将清 洗液 置于 室温 或 37 待结 晶溶 解后 再 进行稀 释。 9.2.2 磁微粒 化学 发光 法反 应体 系和反 应程 序 取 1 ml 样本稀 释液 ，加
17、入 20 样本 （至 少 15 ），用漩涡 混匀 仪混 匀 5 s ，静 止 15 min 后 开始实 验。根 据实 验需要 ，在质 量控制 时， 设置阴 性、阳 性对照 各 2 管及 处 理后样 本若干 。分 别加 入 50 磁性颗粒- 抗荧 光素 抗体、75 处理后 样本 或阴性 对照/ 阳性 对照 、50 荧光素标记 新型 冠 状 病毒重 组抗 原、75 碱 性磷酸 酶标 记鼠 抗人 IgG 单克隆 抗体 。 反应 时间 35 min ； 完成第 二次 清洗 后 每管加 入底 物液 200 ，避光检 测， 反应 5 s 读数。 磁微 粒化 学发 光法 反应 体系的 总体 积可 根据 不
18、同 厂家、 型号 的化 学发 光仪 做相应 调整 。 9.2.3 结果判 读 根据 RLU 自动 计算 Cutoff 值，样 本检 测的 结果 以 S/CO 值 进行 判定 a) 阴性（ ） ：S/CO 1.000 ，待 检样 本未 检出 新型 冠状病 毒 IgG 抗体 ； b) 阳性（ ） ：S/CO 1.000 ，待 检样 本检 出新 型冠 状病毒 IgG 抗 体。 9.2.4 质量控 制 根据不 同厂 家 、 型 号的 化 学发光 仪和 配套 试剂 的要 求， 阳性 、 阴 性对 照 S/CO 应在 规定 的范 围内。 以上要 求不 符合 ，应 重新 进行试 验， 重新 进行 的试 验应从 试剂 制备 开始 。 9.2.5 结果表 述 当质量 控制 符合 要求 时， a) S/CO 1.000 ，结 果表 述 为 待 检样 本未 检出 新型 冠 状病毒 IgG 抗体 。 b) S/CO 1.000 ，结 果表 述 为 待 检样 本检 出新 型冠 状 病毒 IgG 抗体 。 _
