1、 ICS 65.020.20 CCS B 21 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2594 2022 紫花苜蓿 组织培养 技术规程 Technical code of practice for tissue culture of medicago sativa 2022-06-24 发布 2022-07-24 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2594 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由内 蒙古 自治 区林 业和草 原局 提出 并归
2、 口。本文件 起草 单位：中 国农 业科学 院草 原研 究所、内 蒙古农 业大 学。本文件 主要 起草 人：徐春 波、王 勇、赵海 霞。DB15/T 2594 2022 1 紫花苜蓿 组织培 养技术规 程 1 范围 本文件 规定了 紫花 苜蓿组 织培养 的术语 与定 义、培 养基、外植体、愈 伤组织 诱导培 养、增 殖培 养、分化培 养、生根 培养、炼 苗与移 栽等 基本 内容 及技 术要求。本文件 适用 于紫 花苜 蓿组 织培养 育苗。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对
3、 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 603 化学 试剂 试验 方法中 所用 制剂 及制 品的 制备 NY/T 2306 花 卉种 苗组 培 快繁技 术规 程 DB15/T 1940 西部 沙樱 组 织培养 技术 规 3 术语和 定义 NY/T 2306 界定 的术 语和 定 义适用 于本 文件。紫花苜 蓿 medicago sativa L.属于豆 科（Leguminosae）苜蓿属（Medicago）多年 生草本 植物。4 环境与 器具 灭菌 按照DB15/T 1940 操 作。5 培养基 基本培 养
4、基 MS 培养 基、1/2 MS、改良SH 培养 基和MSO 培 养基 见附 录A。母液的 配制 和保 存 5.2.1 配制 将常用 试剂 配制 成50 100 倍的母 液，严 格按 照GB/T 603 规 定方 法配 制。所 用激 素均配 制浓 度为0.5 mg/mL，配 制方 法详 见附 录B。DB15/T 2594 2022 2 5.2.2 保存 母液配 制好 分别 贴上 标签，注明 溶液 名称、配 制倍 数、配 制日 期、配制 者。母液贮 存在4 的冰 箱中。贮 藏时 间在3个 月之 内，有霉 菌和 沉淀 产生，则 不准许 使用。培养基 的配 制 5.3.1 配制 配置1 L 培 养基
5、 时，先加 蒸 馏水600 ml 700 ml，再 加入7.5 g 琼脂，加 热搅 拌 琼脂融 化后 加入25 g蔗糖，搅拌 溶解 后再 分别 加入母 液，搅拌 均匀，加 蒸馏水 定容 至1 L。5.3.2 pH 值 调节 用1 mol/L 的NaOH 将 配制 好 的培养 基调 到pH 值5.8 6.0，用 酸度 计或 精密pH 试 纸 测定。5.3.3 分装和 灭菌 配制好 的培 养基 趁热 分装。分装量 以占 培养 容器 的1/4 1/3 为宜。切 勿将 培养 基 沾到瓶 口和 外壁 上，以免招 致杂 菌污 染。分 装后 立即加 盖，不 同的 处理 做好 标记。分 装后 进行 灭菌，12
6、1 状态 下保 持20 min。6 外植体 无菌苗 的培 养 紫花苜 蓿种 子用75%的酒 精 灭菌3 min 5 min，无菌 水 冲洗，再用10%次氯 酸钠 消 毒10 min 15 min，无菌水 冲洗56 次后 用灭 菌的滤 纸吸 干种 子表 面的 液体，接种 到1/2 MS 培养 基上。外植体 的选 择和 制备 取7 d 10 d 无 菌苗 的子 叶 和下胚 轴或15 d 20 d 无 菌苗的 叶片、叶柄 和茎 段，将外植 体剪 成3 mm 5 mm 长 的小 块或 小段。7 愈伤组 织诱 导培 养 培养基 诱导培 养基 为改 良SH+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L
7、6-BA。接种 将外植 体接 种在 愈伤 组织 诱导培 养基 上，每2.5 cm23 cm2接种1个，均 匀摆 放，封 好皿 口，标明 名称和日 期。培养条 件 白天25、晚 上18，每天光 照时 间16 h，光照 强度1000 Lux 2000 Lux。培养时 间 培养20 d 30 d。DB15/T 2594 2022 3 8 增殖培 养 培养基 增殖培 养基1为MSO+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L AgNO3。增殖 培养 基2为MS+0.3 mg/L TDZ。接种 在超净 工作 台上，将 诱导 出的愈 伤组 织转 到增 殖培 养基上，每4 cm2
8、5 cm2接种1个，均 匀摆 放，封好皿口，标 明名 称和 日期。培养条 件 按照7.3 进 行。培养时 间 增殖培 养基1培养14 d 20 d，移到 增殖 培养 基2继 续 培养5 d 7 d，之 后再 移 至增殖 培养 基1 培养10 d15 d。9 分化培 养 培养基 分化培 养基 为MS+0.2 mg/L KT。接种 在超净 工作 台上，将 胚性 愈 伤组织 转入 分化 培养 基，每5 cm26 cm2接种1个，均 匀 摆放，封好 瓶口，标明名 称和 日期。培养条 件 按照7.3 进 行。培养时 间 培 养40 d 50 d；每20 d 换1次 培养 基。10 生根培 养 培养基 生
9、根培 养基 为1/2 MS。接种 在超净 工作 台上，将 长至3 cm 5 cm 的小 苗逐 一转 入 生根培 养基，每 器皿 接种1 苗，封 好瓶 口，标明名称 和日 期。培养条 件 DB15/T 2594 2022 4 按照7.3 进 行。培养时 间 培养20 d 30 d。11 炼苗与 移栽 炼苗 选择生 长健 壮的 组培 苗，打开封 口膜，放 在自 然光、室温 下2 d 3 d。基质 土:草碳:蛭石3:2:1 混合。高压灭 菌后 装入 花盆 备用。移栽 取出组 培苗，洗 掉培 养基，栽入 花盆，浇 水，放入 温室，适当 保温，常 规管 理。待 苗长 至20 cm 30 cm 移栽 至大
10、 田。DB15/T 2594 2022 5 A A 附录A（规范 性）基本培 养基 成分 基本培 养基 成分 见表A.1。表A.1 基本 培养 基成 分 类型 组分 MS 培养基 改良SH 培养基 MSO 培养基 大量元素 KNO3 1900.0 2830.0 1900.0 NH4NO3 1650.0 463.0 1650.0 MgSO4 7H2O 370.0 185.0 370.0 KH2PO4 170.0 400.0 170.0 CaCl2 2H2O 440.0 166.0 440.0 微量元素 MnSO4 4H2O 22.300-22.300 ZnSO4 7H2O 8.600 8.600
11、 8.600 H3BO3 6.200-6.200 KI 0.830-0.830 Na2MoO46H2O 0.250 0.250 0.250 CuSO4.5H2O4 0.025 0.025 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 0.025 铁盐 Na2-EDTA 37.30 37.30 37.30 FeSO4.7H2O 27.80 27.80 27.80 有机物 甘氨酸 2.000-盐酸吡哆辛 0.500 9.500 1.000 盐酸硫铵素 0.100 9.900 10.000 烟酸 0.500-1.000 肌醇 100.000-100.000 尼克酸-4.500-DB15/
12、T 2594 2022 6 B B 附录B（规范 性）激素的 配制 激素的 配制 见表B.1。表B.1 激素 的配 制 类别 名称 配制方法 灭菌方式 存储方式 生长素 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）用适量无水乙醇溶解后加入去离子水定容。高温灭菌 冷藏（4），密封，避光保存 萘乙酸（NAA）细胞分裂素 6-苄基嘌呤（6-BA）用适量 0.1 M 的盐酸（HCL）溶解后加入去离子水定容。高温灭菌 冷藏（4），密封，避光保存 激动素（KT）噻苯隆（TDZ）用适量二甲基亚砜（DMSO）溶 解后加入去离子水定容。过滤灭菌 现配现用 硝酸银 硝酸银（AgNO3）用去离子水溶解后定容。过滤灭菌 现配现用
