1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2727 2022 牛冠状病 毒 腹泻诊 断技术规 范 Technical specification for diagnosis of bovine coronavirus diarrhea 2022-07-29 发布 2022-08-29 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2727 2022 I 前 言 GB/T 1.1 2020 1 SAM/TC 19 DB15/T 2727 2022 1 牛冠状病 毒腹泻 诊断技术 规范 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB 194
2、89 GB/T 27401 3 术语和 定义 4 缩略语 BCoV Bovine coronavirus CPE Cytopathic Effect DMEM DuLbecco s Modified Eagle Medium FBS Fetal Bovine Serum HRT-18 18 Human Rectal tumor-18 cell PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction TCID50 Median Tissue Culture Infective Dose 5 生物安 全措 施 GB 19489 GB/T
3、27401 6 病原 DB15/T 2727 2022 2 80 nm 120 nm RNA 7 临床诊 断 流行病 学 7.1.1 易感动 物 7 7.1.2 传染源 7.1.3 传播途 径 7.1.4 流行特 点 临床症 状 病理变 化 结果判 定 6.1 6.2 6.3 8 实验室 诊断 主要仪 器设 备 T25 CO2 96 PCRPCR 主要试 剂 PBS 2%DMEM HRT-18 PCR Taq DNA Marker TAE A 样品采 集与 处理 DB15/T 2727 2022 3 8.3.1 粪便样 品 3 mL PBS 12000 r/min 4 5 min 8 min
4、8.3.2 组织样 品 1 g 5 mL PBS 8000 r/min 4 5 min 8.3.3 血液样 品 2 mL 4 mL 30 min 3000 r/min 4000 r/min 5 min 10 min 样品运 输与 保存 12 h 2 8 24 h-70 病原学 检测 8.5.1 电镜检 查 PBS 1:4 30 min 3000 r/min 30 min 15000 r/min 30 min 40000 r/min 50000 r/min 4 h 5 h 1 2 2%8.5.2 病毒分 离鉴 定 8.5.2.1 单层细 胞制 备 HRT-18 1 2 106/T25 5%CO2
5、 37 24 h 48 h 8.5.2.2 接种细 胞 1:5 3000 r/min 4 10 min 0.22 m 20 g/mL 30 g/mL 37 1 h 3 10%37 1 h 20 min 15 g/mL 25 g/mL 5%CO2 37 8.5.2.3 观察和 记录 DB15/T 2727 2022 4 4 d 5 d CPE 80%-70 CPE 3 8.5.2.4 盲传 1 CPE 3 8000 r/min 4 5 min 2 CPE 5 7 CPE 80%-70 8.5.2.5 中和试 验 8.5.2.5.1 单层细 胞制 备 1 2 106/96 100 L 1/5%CO
6、2 37 24 h 8.5.2.5.2 固定血 清-稀释 病毒 法 DMEM 10-1 10-8 37 1 h 200 L 96 4 4 5%CO2 37 TCID50 8.5.3 PCR 检测 8.5.3.1 总RNA 提取 RNA-20-70 8.5.3.2 引物合 成 BCoV N N BcoV BCoV-N-F GCAATCCAGTAGTAGAGCGT BCoV-N-R CTTAGTGGCATCCTTGCCAA 8.5.3.3 反应体 系 One step Taq RNase-Free H2 cDNA 2 L 1 L Taq 12.5 L RNase-Free H2O 8.5 L 8.
7、5.3.4 反应参 数 50 30 min 95 15 min 94 1 min 55 30 s 72 1 min 35 72 10 min 95 15 min 94 1 min 55 30 s 72 1 min 35 72 10 min 8.5.3.5 电泳检 测 DB15/T 2727 2022 5 5 L 8 L PCR DNA Marker 1 TAE 8.5.3.6 测序分 析 PCR NCBI Blast BCoV N 8.5.4 ELISA 检测 ELISA 8.5.5 结果判 定 8.5.5.1 电镜检 查结 果 80 nm 120 nm BcoV 8.5.5.2 中和试 验结
8、 果 Reed-Muench B 50(Log 1.7)10 49(Log=1 1.6)10(Log 1)8.5.5.3 PCR 检 测结 果 PCR 460 bp Blast BCoV N 8.5.5.4 ELISA 检测 结果 ELISA 血清学 检测-8.6.1 检测时 间 2 1 8.6.2 血清稀 释 1.5 mL DMEM 100 L 56 30 min 100 L 10 100 L 8.6.3 感作 100 L BCoV 37 1 h 8.6.4 接种 200 L 96 4 1:10 BcoV 1:5 4 BCoV 100 10-3 4 4 DB15/T 2727 2022 6
9、8.6.5 观察和 记录 5%CO2 37 5 d 7 d CPE 8.6.6 结果判 定 4 CPE Reed-Muench B BCoV 1:5 2 2 4 9 综合判 定 疑似 6.1 6.2 6.3 确诊 6.1 6.2 6.3 PCR ELISA 6.1 6.2 6.3 7.6.6 DB15/T 2727 2022 7 A A 附录A（规范 性）试剂配 制 A.1 PBS 缓 冲液 NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.24 g 800 mL HCl pH 7.4 1000 mL 121 15 min A.2 细胞培 养液 DMEM 4
10、4.5 mL FBS 5 mL(10000 U/mL)500 L 4 A.3 细胞维 持液 DMEM 44.5 mL 0.25 g/mL(10000 U/mL)4 A.4 50 TAE 电 泳缓 冲液 Tris 242 g EDTA-2Na 37.2 g 57.1 mL 942.9 mL Tris EDTA-2Na 800 mL 1 moL/L NaOH pH 8.3 1000 mL 50 1 TAE DB15/T 2727 2022 8 B B 附录B（规范 性）中和试 验结 果计 算方 法 B.1 固定血 清-稀释 病毒 法 TCID50=TCID50/TCID50 50(Log 1.7)10 49(Log=1 1.6)10(Log 1)B.2 固定病 毒-稀释 血清 法 PD50 PD50:PD50 50%CPE Reed-Muench 50%50%CPE 50%CPE 50%CPE=(50%-50%)/(50%-50%)PD50 1:
