1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2742 2022 羊溶血性 曼氏杆菌 分 离与鉴 定操作规 程 Operating procedures for isolation and identification of sheep Mannheimia haemolytica 2022-07-29 发布 2022-08-29 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2742 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草
2、。本文件 由内 蒙古 畜牧 业标 准化技 术委 员会（SAM/TC 19）归 口。本文件 起草 单位：内 蒙古 自治区 农牧 业科 学院。本文件 主要 起草 人：张月 梅、赵 世华、宋 越、白帆、王娜、戴 伶俐、张 帆、杨斌、刘威。DB15/T 2742 2022 1 羊溶血性 曼氏杆 菌分离与 鉴定操 作 规程 1 范围 本文件 规定 了羊 溶血 性曼 氏杆菌 分离 与鉴 定的 操作 方法。本文件 适用 于羊 及其 产品 中溶血 性曼 氏杆 菌的 分离 鉴定。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的
3、引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 4789.28 食 品安 全国 家标准 食 品微 生物 学检 验 培养 基和 试剂 的质 量要 求 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。溶血性 曼氏 杆菌 Mannheimia haemolytica，Mh 巴氏杆 菌科 曼氏 杆菌 属的 微生物，球 杆状 或短 杆状 菌，两端 钝圆，革 兰氏 染色 阴 性，典 型两 端深 染，中间浅，单 个或 成双 存在，无鞭 毛
4、，有荚 膜，不形 成芽孢。4 操作步 骤 方法概 要 检验程 序的 流程 示意 图见 附录A。试剂和 材料 4.2.1 除另有 规定，所 用试 剂均 为分析 纯，水为 符 合 GB/T 6682 的超 纯水。4.2.2 普通琼 脂绵 羊血 平板。称 取牛肉 膏3.0 g，蛋 白胨10.0 g，氯 化钠5.0 g，磷 酸二氢 钾 1.0 g，琼脂15.0 g 超纯水 1000 mL，混 合，加热 溶解，调pH 至 7.6，115 灭菌15 min，冷 却至45 时 加入无菌 脱纤 维绵 羊 血 50 mL 并在 无菌 操作 要求 下倾 注约 20 mL 至 无菌 平皿 中。加盖 后在 室温 放至
5、 凝固。制备好 的培 养基 平皿 宜 在2 8 保存。4.2.3 5%马血 清 的TSB。称 取胰 酪胨15.0 g，大豆 木瓜 蛋 白酶水 解 物 5.0 g，氯化 钠5.0 g，超纯 水950 mL，混合，微 热溶解，调 节 pH 值为7.3，121 高压 蒸汽 灭 菌 15 min，冷却至 约60 时添 加 50 mL 马 血清，混 匀。制备 好 的培养 基宜 在 2 8 保存。4.2.4 麦康凯 琼脂 培养 基。称取 蛋白 胨20.0 g，乳 糖10.0 g，牛胆 盐 5.0 g，氯化 钠5.0 g，中性 红DB15/T 2742 2022 2 0.03 g，琼脂14.0 g，超 纯水
6、 1000 mL，混 合，调 节 pH 值为7.1，121 高 压蒸汽 灭 菌15 min，冷 却至约60，在无 菌操 作 要求下 倾注 约 20 mL 至无 菌平皿 中。加 盖后 在室 温 放至凝 固。制 备好 的培 养 基宜在 2 8 保 存。4.2.5 Taq DNA 聚 合酶。4.2.6 琼脂糖：电 泳级。4.2.7 溴化乙 锭。4.2.8 分子量 标记：DL-2000。4.2.9 TE 缓 冲液。10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。仪器和 设备 4.3.1 匀质器 和匀 质杯。4.3.2 天平：称量 范 围 0 g 500
7、 g，读 数精 准 度 0.01 g。4.3.3 核酸电 泳仪。4.3.4 PCR 仪。4.3.5 凝胶成 像系 统 4.3.6 恒温培 养箱：37。4.3.7 恒温水 浴锅：37。4.3.8 高压蒸 汽灭 菌锅。4.3.9 酶标仪。4.3.10 光学显 微镜。4.3.11 恒温摇 床：37。4.3.12 低温离 心机。4.3.13 冰箱。方法 4.4.1 样品采 集 活体样 品可 利用 棉拭 子深 入至鼻 腔内 部采 集鼻 腔分 泌物，剖检 样品 主要 无菌 采集部 分羊 气管、肺 脏或胸水 等组 织样 本，无菌 采集样 品后 应4 保 存，24 h 内 送至 实验 室。4.4.2 细菌的
8、分离 4.4.2.1 鼻腔拭 子的 分菌 鼻腔拭 子样 品放 入到 装有5 mL 5%马 血清TSB 的 试管 中，于37 摇床 以250 r/min 培养12 h 16 h后，划 线接 种于 普通 琼脂 绵羊血 平板，于37 培 养 箱培养12 h 16 h 后 观察 菌落形 态。4.4.2.2 组织样 本的 分菌 用经火 焰灭 菌并 冷却 的接 种环蘸 取待 检组 织内 部后 划线接 种于 普通 琼脂 绵羊 血平板，于37 培养箱培养12 h 16 h 后观 察。或以 无菌 操作 取样 品5 g，加入 装有45 mL，含5%马 血清TSB 的 培养 瓶内，均质，于37 摇 床以250 r/
9、min培养12 h 16 h后，划 线接种 于普 通琼 脂绵 羊血 平板，于37 培养 箱 培养12 h 16 h 后 观察 菌落 形态。4.4.3 细菌的 鉴定 4.4.3.1 培养特征 DB15/T 2742 2022 3 溶血性 曼氏 杆菌 在37 培养16 h后，在普 通琼 脂绵 羊 血平板 和含5%马 血清 的TSA 上形成 圆形 微凸 起、表面光 滑、边 缘整 齐、半 透明的 菌落，直径 约0.3 mm 1.2 mm。培养 超过48 h 后，菌株 呈 溶血 或 溶血。在 麦康 凯琼 脂培 养基 上，该 菌生 长缓 慢，单个 菌落呈 红色。4.4.3.2 病原特征 取组织 样本 做组
10、 织触 片，或取可 疑菌 落涂 片做 革兰 染色（按GB/T 4789.28 的 方法进 行染 色），菌体呈革兰 氏阴 性，可见 粉红 色小杆 菌，直 径约1 m，固体和 液体 培养 基上 生长 时，培养 物均 以单个 菌 落 为主，不 形成 芽孢，有荚 膜（按GB/T 4789.28 的方 法 进行染 色）。菌落 生长 特 征、革 兰染 色、菌 体形 态 和普通琼 脂绵 羊血 平板 溶 血 及麦康 凯培 养基 平板 单个 菌落呈 红色 符合 者，可确 定为溶 血性 曼氏 杆菌。4.4.3.3 生化特 性 经初步 鉴定 后，细菌 在37 培养16 h 后，生 化试 验 结果显 示分 离菌 均能
11、 发酵 葡萄糖、乳 糖、麦芽糖、L-阿拉 伯糖 等糖 类，发酵甘 露醇，不 发酵 甘露 糖，氧 化酶、触 媒阳 性，尿酶阴 性。4.4.4 玻片凝 集试 验 将可疑 菌落 接种 于5%马血 清TSB，37 培养16 h，取1.5 mL培 养物，经12000 r/min 离心1 min，弃上清，用100 L生 理盐 水 将沉淀 物制 成悬 浮液，取25 L 悬浮 液分 别和 等体 积 的生理 盐水、溶 血性 曼氏杆菌 阳性 血 清 作玻 片凝 集试验，其 中生 理盐 水作 为稀释 液对 照并 观察 待检 菌株是 否有 自凝 现象。同 时设阳性 菌株 对照。在 生理 盐水对 照不 凝集，阳 性菌
12、株凝集 的情 况下，待 检菌 株出现 凝集 为阳 性反 应。4.4.5 溶血性 曼氏 杆 菌 16S rRNA 测序检 测 4.4.5.1 PCR 扩增 用无菌 接种 环钩 取培 养基 上可疑 单菌 落至 含有16S rRNA PCR 反 应混 合物 的PCR 管中，引物 序列 参见附录B，混 匀，进行PCR 扩 增，同 时设 置阳 性对 照和 阴性对 照。扩增 条件 为95 预变 性3 min；95 变性20 s，55 退火30 s，72 延伸40 s，32 个循 环；72 延伸10 min，4 保存。4.4.5.2 琼脂糖 凝胶 电泳 在电泳 缓冲 液中 加入1%琼 脂糖，加热 融化 后加
13、 入溴 化乙锭 制备 凝胶，凝 固后 进行电 泳。8 L PCR产物加 入2 L 上 样缓 冲液，混匀 后加 入上 样孔，80 V恒压 电泳25 min，放 入凝 胶成像 系统 紫外 线透 射检验。4.4.5.3 测序结 果比 对 凝胶电 泳成 像结 果显 示扩 增条带 在1400 bp 处，且无 杂带后，可 将PCR 产物 测序，测序 结果 与标 准 序列进行 比对。5 结果判 定 同时符 合以 下特 性者 应判 为溶血 性曼 氏杆 菌：溶血性 曼氏 杆菌 在 37 培养16 h 后，在普 通琼 脂 绵羊 血 平板 和 5%马 血清 的TSA 培 养基 平板上形 成圆 形微 凸起、表 面光滑
14、、边 缘整 齐、半透 明的菌 落，直径 约 0.3 mm 1.2 mm，大多数菌 株呈 溶 血，部分 菌株产 生 溶血；麦 康凯 培养基 平板 上单 个菌 落呈 红色；革兰氏 阴性 短杆 菌，大多 数单个 存在；DB15/T 2742 2022 4 发酵葡 萄糖、乳 糖、麦芽 糖、L-阿拉 伯糖 等糖 类，发酵甘 露醇，不 发酵 甘露 糖，氧 化酶、触媒阳性，尿 酶阴 性；与溶血 性曼 氏杆 菌阳 性血 清玻片 凝集 试验 阳性；16S rRNA 序列 比对 与曼 氏 杆菌属 为同 一进 化分 支。6 废弃物 处理 和防 止污 染的 措施 依据 病死 及病 害动 物无 害 化处 理技 术规 范
15、 对废 弃物进 行无 害化 处理。DB15/T 2742 2022 5 A A 附录A（规范 性）溶血性 曼氏 杆菌 检测 羊溶血 性曼 氏杆 菌检 测流 程见图A.1。图A.1 羊溶血 性曼 氏杆 菌检 测流 程图 DB15/T 2742 2022 6 B B 附录B（资料 性）溶血性 曼氏 杆 菌 16S rRNA 序列的 扩增 溶血性 曼氏 杆菌16S rRNA 序列的 扩增 引物 见表B.1。表B.1 用于16S rRNA 序列 扩增 的引物 引物 序列 27-F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492-R 5-TACCTTGTTACGACTT-3 DB15/T 2742 2022 7 参考文 献 1 中 华人 民共 和国 农业 部病.死及 病害 动物 无害 化 处理技 术规 范.2017 年.
