1、NY 335 - 1998 前言本标F挂出农业部科学技术与员量标准司提出并归口。本标准起草单位z中国农业大学。本标樵主要起尊人s梅汝鸿、徐维徽、蒋慧敏。I S 中华人民共和国农业行业标准增产菌生产工艺流程NY 335-1998 Production technological process of yield-increasing bacteria 1 范围本标准规定r增产菌芽于包杆菌(Bacillussp. )的生产工艺流程、技术要求和操作规程。本标准适用于以芽袍杆菌为菌种，经液体深层发酵法生产增产菌粉剂产品的发酵工艺。2 引用标准F列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文
2、。本标准出版时，所示版本均为高效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。HG!T 3309-J983 农药粉剂细度测定方法(原HG/T2 896-83) NY 334- J 998 增产菌粉剂3 总则增产菌属芽抱杆菌是依据植物微生态学原理研制出的一种微生态制剂。增产菌生产工艺流程选用芽抱杆菌为菌种，经液体深层发酵法制成粉剂。主要环节为原菌种活化菌种扩大培养种子罐培养发酵罐培养添加填充料压滤干燥粉碎粉剂质量检测一，包装产品检测。4 技术要求技术要求见表1。表1步骤项目名称技术指标温度121125-C 灭菌要求压力实消压力0.11MPa l 空消压力0.11MPa
3、 时间30 mn 温度2830C 压力Q. 05 MPa 2 培养条件通气量1 l(每分钟进出空气体积比)pH值7. O7. 5 含菌量二注30亿个/g3 放罐指标芽泡形成量二三70%杂菌量三三0.3%中华人民共和国农业部1998-06-11批准1999- 01-01实施I 1们NY 335-1998 表J(完步骤项目名称技术指标f可菌古董300亿个Ig古7主戴芝二5%成品栋准4 细度0.09 mm孔径筛杂菌最1% 5生产工艺流程E主菌种添花葛种扩大培养发群雄培养泌填充料挤压滤干燥粉碎成品检验包装6 菌种生产操作规稳6. 1 仪器设备和试剂无菌室或超净工作台、灭商锅、试管、克氏瓶、冰箱、温箱、
4、显微镜、氢氧化锅、盐酸、氯化锅、牛肉膏、蛋白炼和势;黯等。6.2 培养葵哥哥备按如下面已方制备培养基:牛肉膏。.3%.蛋白陈1%.氯他纳0.5%.琼脂2%。将琼脂加热榕化后用。每1mo!L氮氧化纳渎。.1mol/L盐酸i黯pH镶7.O7. 5.然后分辈辈克沃瓶或试管，凳子灭m锅内，在0.11 MPa 压力下灭前30min，冷却后制成斜面备用。6.3 菌种治化与扩大培养用培养基在无穰条件下从草草蔼矜斜顶上换取少i午离苔，置放试管裂主哥内进行JttJ线，然后皇室2830C温箱内培养24h.经检查混杂菌，由自体生长黎齐，再置于2830C温箱内培养2428h.肉眼观察，蔼丰满，涂片、染色饺查无杂弱，芽
5、抱大小一致的.可放冰箱中存放备用(4c左右为钱。涂片、染色方法按7.Z. 8.3规定进行。7 发董事生产操作规稳7. 1 仪器设备和试齐rj种子辙、发酵罐、水浴锅、显微镜、裁玻片、克氏瓶、三角瓶、试管、吸管、血球计数板、氮氧化销、盐酸、氯化锅、pH试纸、溶稿、品红、孔雀绿等。7.2 种子罐培养7.2. 1 洁养基种子辙培养基所用碳原主要有葡萄糖、玉米浆、淀粉、精糖、植物?自(兼消泡齐j) ;氮原主要辛苦花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、无机盐及微锺元素。般发酵参考如下配方装料:花生饼粉0.5%.鱼粉0.3%，玉米浆0.5% ，慈善草糖0.3%，豆泌o.2%O. 3%(或滋滋0.3%)。7.2.2 空发酵
6、罐灭菌发酵嫌在应用?事j清洗干净，排除污物.并在Q.11MPa压力下灭菌30min 7.2.3 种子罐装料参考7.2. 1的自己方比例装料，投料庭不得越过罐容积的70%。7.2.4 发潜罐灭蔼装好料后，在O.lJ MPa 阻力下灭隘30min，冷却至30C后&10接手中。7.2.5 种子罐接种7.2.5.1 悬浮液ilitl备在无商条件下将每个克氏瓶斜面冒商种加100mL无前水，把商答击J下制成于包子悬浮液，含营商量为10亿个茵体Iml川并在80C恒温水锅中处理20m1n o , !叮NY 335-1998 7.2.5.2接称将制好的泡F悬浮液，在无随条件下接种后，校1%的比例接种子冷却至30
7、C的种子罐内进行培养。7.2.6 手中子辈革培养条中的控哥哥J在种后在温度为28-30仁，成为0.05MPa.)血气量1 1 (每分钟迸出空气体帜比)和220r/min搅拌条伶下，培养8JOh。7. 2. 7 发酵罐培养过程中的检测接种后4h开始，能隔2h取样一次按i邸，包括菌体生长状况、含商量和pH值，达到如下指标，即可移称至发酵罐内发酵烧葬。a)茵体1:+毛整齐;b)处于对数生长期:c)含菌鼓2亿1/mL以上zd)无杂西哥污染。7.2.8 检测方法7.2. 8. 1 取样在无菌条件下.取堵养液50-100mL.子灭菌三角瓶中，检测备用。7.2.8.2 pH值的源节用pH试纸(适用我E阁pH
8、俄4-引进行比色，用滴管将一滴发酵液滴J1JpH试纸上，观察试纸上指示剂颜色变化.用比色长进行比色来确定发酵液的pH值，并用1mol/L的氢氧化销或裁酸调节发酵液的pH值，使发酵液pH值保持在7.0-7.5左右。7.2.8.3 菌体生1:状况I!:I涂片、染色法观察湛体生沃状况。用无离吸号音或接矜环激发酵液一满或2-3漓，j墨子洁净辈辈泼片七，用移种环在玻片上均匀涂抹，干燥后用孔雀绿、藏红染色法将菌体和芽于自染成不同颜色，在显微镜下观察。7.2.8.4 染色步骤孔雀绿0.5%的水溶液染色剂I或碱性品红配制成0.05%的水溶液染色剂E。在固定好的涂片上加染色剂I.繁酒精灯火焰上微加热染色1mn，
9、勿使染色液沸腾和干燥，用水洗去染色液后，加染色剂II j染色15min!再用水洗去染色液，用吸水纸吸干p可在投微镜下观察，注意此时菌体染成微红色，芽泡染成绿色。7.2.8.5 含章苦范)最检测用血球i十数法观察窗体抱体的数量，将发酵液用无菌水稀释至10-101倍备用(适宜的倍数为准入再将洁净袭玻片放在血球t敬板上有费l度的位置上，从盖玻片的一侧细小滴稀释的发酵液(使每小格只有5-10于包子为交)。再在显微镜下观察每个小榕的穿于邑霞数戳，每视野夹克察80个小楼，以平均数乘以10t再乘以稀释倍数，即为发酵液的含藩数每次t数测定应不少于五个视野数(即不少于5X80个小楼部平均数入其含葱量nl按式(l
10、)计算z式中:C稀释倍数;D 80个小格的芽泡总数;D X C . . . nl =一.一X4 X 10。, 80 4XJO ffil球计数板每小格容积换算成1mL容积的常数。7.3 发酵罐发酵生产7. 3. 1 发酵罐空消发酵罐1E接种言苦苦苦经过严格灭茵处嫂，洗净兹在0.11MPa 压力下灭蔼30min 1 ):-; 国(1 ) NY 335-199在7.3.2 发酵罐投料自己方=花生饼粉2%.鱼粉。.3%.玉米浆1.8%，精精0.5%，硫酸馁。.075%.碳酸铐0.5%，硝酸二氢仰004%，EZ油。1%或泡敌0.05%，用1mol/L氮氧化销或1mol/L盐酸调pH值7睛。7.5左右，投
11、李宁遂不得超过罐容积的75%。7.3.3 发酵罐培养发酵培养条件:搅拌速度180-200r/min，罐底0.05MPa.移种后4h内涵气量为10.70.8(每血in体积之比)，以后逐渐增大3il 10 般发事李培养毒草骂为18-24忆在芽郑大量形成，个别穿于程开始脱落时，符合7.3. 5放罐指标，即可放罐。7.3.4 发喜事过程中的检测内容及检测方法投料后4h开始，每隔Zh取样检测次，至18h后，取中羊i可隔缩短为0.5-1h。达到如下指标NP，守放辙。a)芽蕴含量二三70%; b)杂菌污染0.3%; c)含菌戴二，30亿个1m!.。7.3.5 检泌指标与检溃i方法向7.乙7辛苦7.2. 80
12、 8 后处理操作规程8.1 仪器设备f世拌机、板框、干燥机(装置是)、超细度粉碎机等。8.2 吸隙)lJ一般采用的粒度为0.09mm孔径筛的轻质碳酸钙为吸附填加剂，iJu入最接式(2)汁算s领附秀才灼量才醒鸣在辑也睡+则瞅瞅投料送( z ) 8. 3 压滤按8.2规定加入吸附剂后，机械搅拌3-5h.使窗子包全部被吸附.然后再用极框压1撑。8 4 干燥将板框滤后的协饼捣碎后，置于烘干机或烘干装置内进行烘干。烘干时的温度不超过70C.要不断翻动，使受热均匀。当含水里在5%H宁，那可进行粉碎毛包装。8. 5 粉碎利用离细度粉碎饥粉碎.100%通过0.09mm孔径筛。9 成品枪验按NY334执行含水E辑用干燥失建法(重量重法测定，含水率5%为合格，细度采用湿筛?会测定-100%通过。.09mm于L径筛为合格，具体方法按HG!T3309-1983中湿筛法测定。10 包装按NY334执行。用聚乙烯袋20g包装，每50袋装一大袋，每箱10大袋，净重)0k日，于干燥通风处贮存，保存期3年。t99
