1、NY 335一1998前言本标准由农业部科学技术与质量标准司提出并归口。本标准起草单位:中国农业大学.本标准主要起草人:梅汝鸿、徐维敏、蒋慧敏。中华人民共和国农业行业标准增产菌生产工艺流程NY 335一1998Production technological process of yield-increasing bacteria，范围本标准规定r增产菌芽饱杆菌(Bacillus sp.)的生产工艺流程、技术要求和操作规程。本标准适用于以芽袍杆菌为菌种，经液体深层发酵法生产增产菌粉剂产品的发酵工艺2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为
2、有效所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。HG/T 3309-1983农药粉剂细度M9定方法(原HG/T 2-896-83)NY 334一1998增产菌粉剂3总则增产菌属芽袍杆菌是依据植物微生态学原理研制出的一种微生态制剂增产菌生产工艺流程选用芽抱杆菌为菌种，经液体深层发酵法制成粉剂。主要环节为原菌种活化，菌种扩大培养、种子罐培养发酵罐培养添加填充料压滤、干燥，粉碎，粉剂质量检测包装产品检测。4技术要求技术要求见表1e表1步骤项目名称技术指标1灭菌要求温度121-125-C压力实消压力0. 11 MPa空消压力0. 11 MPa时间30 min2月企星th冬温
3、度28 30C压力0. 05 MPaa卜5RIT通气量1 e 1(每分钟进出空气体积比)pH值7. 0-7. 53放罐指标含菌量30亿个/9芽泡形成量70%杂菌量G0.3%中华人民共和国农业部1998一06门1批准1999一01一01实施NY 335一1998表1(完)步骤项目名称技术指标4一成品标准含菌龟 30。亿个!g含水豪一5%一细度0. 09 mm孔径筛杂菌毋成1%5生产工艺流程原菌种活化、菌种扩大培养发酵罐培养、加填充料、压滤千燥一粉碎成品检验，包装6菌种生产操作规程6.飞仅器设备和试剂无菌室或超净工作台、灭菌锅、试管、克氏瓶、冰箱、温箱、显微镜、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、牛肉膏、蛋白
4、陈和琼脂等6.2培养基制备按如下配方制备培养基:牛肉膏0.30a，蛋白陈I%,氯化钠0.5%，琼脂2%。将琼脂加热溶化后用。1 mol/I氢氧化钠或。1 mol/t.盐酸调PH道7。一7.5,然后分装克氏瓶或试管，凳于灭菌锅内，在0.”MPa压力下灭菌30 min，冷却后制成斜面备用。6.3菌种活化与扩大培养用培养基在无菌条件下从原菌种斜面上挑取少许菌苔，置放试管斜面内进行划线，然后置28-30 C温箱内培养24 h经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于28-30C温箱内培养24-28 h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片、染色检查无杂菌，芽饱大小一致的，可放冰箱中存放备用(4 C左右为宜)。涂片、染色方
5、法按7. 2.83规定进行.7发酵生产操作规程7.1仪器设备和试剂种子罐、发酵罐、水浴锅、显微镜、载玻片、克氏瓶、三角瓶、试管，吸管、血球计数板、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、PH试纸、酒精、品红、孔雀绿等。了.2种子罐培养7. 2.1培养基种子罐培养基所用碳原主要有葡萄糖、玉米浆、淀粉、糊精、植物油(兼消泡剂;氮原主要有花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、无机盐及微量元素一般发酵参考如下配方装料:花生饼粉。5%,鱼粉0.3%，玉米浆。.5%,葡萄糖。.3%，豆油。2%一。3%(或泡敌。.3%)7.2.2空发酵罐灭菌发酵罐在应用前清洗干净，排除污物.并在。.11 MPa压力下灭菌30 min,了.2.3种子罐装
6、料参考7. 2. 1的配方比例装料，投料量不得超过罐容积的70 0o7. 2. d发酵罐灭菌装好料后，在。.11 MPa压力下灭菌30 min，冷却至30C后即可接种。了2.5种子罐接种7.2.5.1悬浮液制备在无菌条件下将每个克氏瓶斜面菌种加亿个菌体/ml，并在so c恒温水锅中处理20100 m工无菌水，把菌苔刮下制成饱子悬浮液，含菌量为10n11nNY 335一19987.2-5.2接种将制好的抱子悬浮液，在无菌条件下接种后，按1%的比例接种于冷却至30C的种子罐内进行培养7. 2. 6种子罐培养条件的控制接种后在温度为2830 C,压力。05 MPa,通气量1:1(每分钟进出空气体积比
7、)和220 r/min搅拌条件下，培养8-10 h,7.2.7发酵罐培养过程中的检测接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，包括菌体生长状况、含菌量和PH值，达到如下指标，即可移种至发酵罐内发酵培养。)菌体生长整齐;b)处于对数生长期;。)含菌量2亿个/ml_以上;d)无杂菌污染。7. 2. 8检测方法7.2.8，取样在无菌条件下.取培养液50-100 ml。于灭菌三角瓶中，检测备用。7. 2.8.2 PH值的调节用PH试纸(适用范围PH值4-8)进行比色，用滴管将一滴发酵液滴到PH试纸上，观察试纸上指示剂颜色变化，用比色卡进行比色来确定发酵液的PH值，并用1 MOO，的氢氧化钠或盐酸调节发酵液
8、的PH值，使发酵液PH值保持在7. 0-7-i左右。7.2.8.3菌体生长状况用涂片、染色法观察菌体生长状况。用无菌吸管或接种环取发酵液一滴或2-3滴，置于洁净载玻片L，用移种环在玻片上均匀涂抹，干燥后用孔雀绿、藏红染色法将菌体和芽抱染成不同颜色，在显微镜下观察7.2-8.4染色步骤孔雀绿0.5%的水溶液染色剂1或碱性品红配制成。.05%的水溶液染色剂a。在固定好的涂片上加染色剂1，置酒精灯火焰上微加热染色1 min，勿使染色液沸腾和千燥，用水洗去染色液后，加染色剂皿染色15 min，再用水洗去染色液，用吸水纸吸干即可在显微镜下观察，注意此时菌体染成微红色，芽饱染成绿色。7.285含菌(抱)量
9、检测用血球计数法观察菌体抱体的数量，将发酵液用无菌水稀释至101-100倍备用(至适宜的倍数为准)。再将洁净盖玻片放在血球计数板上有刻度的位置上，从盖玻片的一侧加小滴稀释的发酵液(使每小格只有5-10袍子为宜)。再在显微镜下观察每个小格的芽抱菌数目，每视野观察80个小格，以平均数乘以10“再乘以稀释倍数，即为发酵液的含菌数。每次计数测定应不少于五个视野数(即不少于5X80个小格的平均数)。其含菌量二:按式(1)计算:n,二DX8GC, X4 X10.，.，、，(la式中:C一一稀释倍数;D-8。个小格的芽抱总数;4 X 10-血球计数板每小格容积换算成1 ml，容积的常数。7.3发酵罐发酵生产
10、731发醉罐空消发酵罐在接种前要经过F格灭菌处理，洗净后在。二11 MPa压力下灭菌30 min,NY 335一1998了32发酵罐投料配方:花生饼粉2%，鱼粉。3%，玉米浆1.80,糊精。5%,硫酸镁。.075%,碳酸钙。5%,磷酸二氢钾0.0400,豆油0.1%或泡敌。.05，用1 moll氢氧化钠或1 mol/L盐酸调pH值7.0-7.5左右，投料最不得超过蟠容积的70%73，3发酵罐培养发酵培养条件:搅拌速度180-200 r/min,罐压0. 05 Mpa，移种后4h内通气量为1，。70.8(每min体积之比)，以后逐渐增大至1:1。一般发酵培养周期为18-24 h，在芽抱大量形成，
11、个别芽抱开始脱落时，符合7. 3. 5放罐指标，即可放罐7. 3. 4发酵过程中的检测内容及检测方法投料后4h开始，每隔2h取样检测一次，至18h后，取样间隔缩短为。5-1 h达到如下指标即可放罐7卜3a)芽抱含量)70%b)杂菌污染毛0.300;。)含菌量李30亿个/ml5检测指标与检侧方法同7.2.7和72.8,8后处理操作规程B.1仪器设备搅拌机、板框，干燥机(装置)、超细度粉碎机等8.2吸附剂一般采用的粒度为。吸附剂的量8.3压滤09 mm孔径筛的轻质碳酸钙为吸附填加剂，加入量按式(2)计算:发酵液体积X发酵液含菌量300亿个/g+5080 yo固体投料量“(2)按8. 2规定加入吸附
12、剂后，机械搅拌3-6 h，使菌抱全部被吸附，然后再用板框压滤。8. 4干燥将板框压滤后的滤饼捣碎后，置于烘干机或烘干装置内进行烘干。烘干时的温度不超过7oC，要不断翻动，使受热均匀。当含水率5%时甲即可进行粉碎、包装8，5粉碎利用高细度粉碎机粉碎，100%通过。09 mm孔径筛9成品检验按NY 334执行。含水率用干燥失重法(重量法)测定，含水率5%为合格，细度采用湿筛法测定、1.00%通过0. 09 m。孔径筛为合格，具体方法按HG%T 3309-1983中湿筛法测定飞Q包装按NY 334执行。用聚乙烯袋20 g包装，每50袋装一大袋，每箱10大袋，净重1 o kg，于千燥通风处贮存。保存期3年。
