1、ICS 65.020CCS B 16DB6111杨 凌 农 业 高 新 技 术 产 业 示 范 区 地 方 标 准DB 6111/T 1722021猕猴桃病毒鉴定技术规程Technical standard for virus identification in kiwifruit seedlings2021-10-22 发布2021-11-01 实施杨凌示范区市场监督管理局发 布DB6111/T 1722021I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则起草。本文件由西北农林科技大学提出。本文件由杨凌示范区农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位
2、：西北农林科技大学、陕西省农村科技开发中心。本文件起草人：赵磊、徐明、刘佩、吴云锋、雷玉山。本文件由西北农林科技大学和陕西省农村科技开发中心负责解释。联 系 人：赵磊联系方式：18792627895联系地址：杨凌示范区邰城路3号DB6111/T 17220211猕猴桃病毒鉴定技术规程1范围本文件规定了猕猴桃病毒鉴定技术的术语和定义、检测对象、取样部位、抽样、鉴定方法和判定规则。本文件适用于杨凌示范区猕猴桃母本树、猕猴桃苗木的病毒鉴定。环境相似的猕猴桃产区可参照执行。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猕猴桃母本树stock plant of
3、kiwifruit提供猕猴桃种条或建外植体所需要幼嫩枝条的猕猴桃母株。3.2猕猴桃苗木 Kiwifruit seedling经扦插、嫁接、组培等方式繁育的猕猴桃种苗。3.3逆转录-聚合酶链式反应 Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）提取猕猴桃检材的总RNA，以其中的mRNA为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行聚合酶链式反应。4检测对象猕猴桃主要病毒：a)猕猴桃病毒 A（Actinidia virus A,AcVA）；b)猕猴桃病毒 B（Actinidia virus B，AcVB）；c)猕猴桃病毒
4、 C（Actinidia virus C，AcVC）；d)猕猴桃褪绿环斑相关病毒（Actinidia chlorotic ringspot-associated virus,AcCRaV）；DB6111/T 17220212e)黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）；f)苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus,ASGV）；g)马铃薯 X 病毒（potato virus X,PVX）；h)柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）；i)猕猴桃病毒 1（Actinidia virus 1，AcV-1）；j)猕猴
5、桃褪绿环斑病毒(Actinidia yellowing ringspot virus,AYRSpV）；k)猕猴桃黄化病毒 1（Actinidia yellowing virus 1,AcYV1）；l)猕猴桃黄化病毒 2（Actinidia yellowing virus 2,AcYV2）；m)猕猴桃种传潜隐病毒（Actinidia seed-borne latent virus,ASbLV)。4.1抽样4.1.1 猴桃母本树每株均需检测。4.1.2 出圃苗木采用5点取样法随机抽取。1万株以内抽检100株（含1万株）；1万株10万株（含10万株），首个1万株抽100株，之后每增加1万株增检50株
6、，不足1万株按1万株计；超过10万株，第1万10万株按上述方法抽样，之后每增加1万株增检20株，不足1万株按1万株计。5取样部位生长季节取幼嫩叶片放置于自封袋内，4 保存不超过24 h或放置于-80 长期保存备用；休眠季节剪下枝条，撕开表皮用小刀刮取1 g左右韧皮部组织，立即使用或放置于-80 保存备用。6鉴定方法6.1双抗体夹心酶联免疫法（DAS-ELISA 法）详见附录A。6.2逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR 法）详见附录B。7判定规则酶联免疫检测或RT-PCR检测呈阳性反应的判定为携带病毒。脱毒母本树带毒率为0、出圃苗木带毒率3.0%判定为合格苗木。DB6111/T 172202
7、13AA附录A（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫检测法（DAS-ELISA 法）A.1溶液配制A.1.1所用化学试剂均为分析纯级规格，用水为蒸馏水。A.1.2抽提缓冲液抽提缓冲液的配制见表A.1。表 A.1抽提缓冲液的配制药品名称质量g三羟甲基氨基甲烷(Tris)60.50氯化钠（NaCl）8.00聚乙烯吡咯烷酮（PVP）,MW4000020.00聚乙二醇（PEG）10.00吐温-20（Tween-20）0.50注：溶于900 mL蒸馏水中，用盐酸将溶液pH值调整到8.2，再用蒸馏水定容至1000 mL，4 下保存，有效期1年。A.1.3洗涤缓冲液洗涤缓冲液的配制见表A.2。表 A.2洗涤缓冲液
8、的配制药品名称质量g氯化钠（NaCl）8.00磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.15磷酸二氢钾（KH2PO4）0.20氯化钾（KCl）0.20吐温-20（Tween-20）0.50注：溶于900 mL蒸馏水中，用盐酸将溶液pH值调整到7.4，再用蒸馏水定容至1000 mL，4 下保存，有效期1年。A.1.4包被缓冲液包被缓冲液的配制见表A.3。DB6111/T 17220214表 A.3包被缓冲液的配制药品名称质量g碳酸钠（NaCO3）1.59碳酸氢钠（NaHCO3）2.93溶于 900mL 蒸馏水中，用盐酸将溶液 pH 值调整到 9.6，再用蒸馏水定容至 1000 mL，4下保存，有效期 1
9、年。A.1.5酶标抗体稀释缓冲液酶标抗体稀释缓冲液的配制见表A.4。表 A.4酶标抗体稀释缓冲液的配制药品名称质量g牛血清蛋白（BSA）2.00聚乙烯吡咯烷酮（PVP）,MW4000020.00溶于 900 mL 蒸馏水中，再用蒸馏水定容至 1000 mL，4 下保存，有效期 1 年。A.1.6底物缓冲液底物缓冲液的配制见表A.5。表 A.5底物缓冲液的配制药品名称质量/体积六水氯化镁（MgCl26H2O）0.10 g二乙醇胺（MDEA）97.00 ml溶于 900 mL 蒸馏水中，用盐酸将溶液 pH 值调整到 9.8，再用蒸馏水定容至 1000 mL，4 下保存，有效期 1 年。A.1.7底
10、物溶液秤取5 mg 4-硝基苯基磷酸二钠盐（PNP）溶解于5 mL底物缓冲液，现配现用。A.2操作步骤A.2.1样品制备取待检样品0.4 g，加入2 mL抽提缓冲液，用研钵研磨至无可见颗粒的糊状，4，10000 rpm离心10 min，取上清液备用。A.2.2包被抗体用抗体包被缓冲液，按相应病毒抗体稀释倍数稀释。酶标板每孔加入120 L抗体稀释液，37 保湿孵育2 h或4 保湿过夜。DB6111/T 17220215A.2.3洗板用洗涤缓冲液浸泡洗涤抗体孵育的酶标板3次，每次3 min5 min。A.2.4包被样品酶标板每孔加110 L制备的样品，37 保湿孵育2 h或4 保湿过夜。同时设阴性
11、、阳性和空白对照，设置3次重复。阳性对照为含有目标病毒的材料；阴性对照为不含有目标病毒的健康猕猴桃叶片；空白对照为包被缓冲液。A.2.5洗板同A.2.3。A.2.6包被酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按照酶标抗体说明书的稀释倍数将其稀释，每加样孔加100 L经过稀释的酶标抗体，37 保湿孵育2 h或4 保湿过夜。A.2.7洗板同A.2.3。A.3加底物酶标板每孔加入90 L底物溶液，室温避光反应1 h。A.4终止反应酶标板每孔加入3 mol/L的NaOH溶液50 L终止反应。A.5酶联检测用酶标仪检测终止反应的酶标板，读取405 nm 的光吸收值（OD405），记录数据。A.5.1判断规则按照表A
12、.6判定结果：表 A.1 结果判定项 目指标判定（检测样品OD405-空白对照OD405）/（阴性对照OD405-空白对照OD405）2.0阳性1.52.0疑似阳性1.5阴性注：疑似阳性样品用 RT-PCR 法核验检测确定DB6111/T 17220216BB附录B（规范性附录）逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR 法）B.1试剂盒B.1.1植物RNA提取试剂盒：选择适合提取含有多糖多酚材料的RNA试剂盒。B.1.2反转录试剂盒：使用市售的商品反转录试剂盒，按照说明进行操作。B.1.3PCR扩增试剂盒：使用市售的商品PCR扩增试剂盒，按照说明进行操作。B.2引物病毒PCR检测特异性引物见表B
13、.1表 B.1猕猴桃病毒的特异性引物病毒引物名称引物序列5-3片段大小bpAcV-1AcV1-CPFTGAGCTRGGRATAGATGTTGC376AcV1-CPRTCTCTCAGGGTTMGGATGAGTAcYV1AcYV1-FCAACGCCGCAAACATCCTTAT624AcYV1-RCACCTGCTTCTCACAAACAGTCTCAAcYV2AcYV2-FAAAACAACTCAACAGAAACGCACTA530AcYV2-RTTCCCTGAAGTAGACAGAATAGACGAYRSpVAYRSpV-FTTTGGACTGGGAACGTAGAGG337AYRSpV-RCGAGAAAGTGA
14、GGTTATCGGGAcVAAcVA FCATGGCAAAGAATATCTCAAG471AcVA RAGATCCAACCCAGAGTTGAAAAcVBAcVB5FGTTTGCGAGGAGACGTAGGGC342AcVB5RAGTTAAGTGCTCTYGGRGGTGTGAcVCAcVCF6AAAGAACCCTACCTCCACC1106AcVCR6CCATCTATATCTCAACAGCCTGCTCGAcCRaVAcCRaV3FATCCAAGAATTCCTTAACAGCA477AcCRaV3RTGTGCAATCATGGCTTATCAGAASGVASGV-UCCCGCTGTTGGATTTGATACAC
15、CTC499ASGV-2GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCCCMVCMV FGAGTCGTGCGTTTTCTTTGTGTTTT183CMV RAATGGCGAGGGTTTTATTGAGTCCLBVdCLBV-F2TATTGGCAGGAGCTGAGGCAG144dCLBV-R2CGGTCAGCGGTTGTTCATGCPVXPVX FAGTGCGCGAGGTTTACCAATC790PVX RGTGGTTTGCCGCGAACGATTCASbLVASbLV-FCAGATGTCTCAAGTTATGTCCGA848ASbLV-RTAGCAAGACATTGGCCTTATTAB.3操作步骤B
16、.3.1猕猴桃RNA提取DB6111/T 17220217B.3.1.1提取方法按照试剂盒操作说明书提取。B.3.1.2判定规则采用电泳法检测，RNA有两条条带，条带清晰明亮；紫外分光光度计测得OD260/OD280比值2.0以上、浓度50 ng/L以上的，以此为模板直接进行反转录或置于-80 条件下保存。不符合以上指标的需重新提取。B.3.2逆转录按照试剂盒操作说明书提取。B.3.3病毒检测B.3.3.1PCR扩增B.3.3.1.1PCR的反应体系在PCR反应管中依次加入12.5 L 2MIX、病毒特异性检测上下游引物各1 L、cDNA模板0.5 L、无菌蒸馏水10 L，PCR反应体系为25
17、 L。目标病毒对应检测引物见表B.1。B.3.3.1.2PCR反应程序将PCR管放入PCR仪中，95 3 min；进行35次循环（95 30 s，52 30 s，72 50 s）；72 5 min，取出PCR反应管，采用凝胶电泳法检测反应产物。B.3.3.2电泳检测制备1%的琼脂糖凝胶，每个泳道加入10 L的PCR产物，100V恒压电泳30 min。B.3.3.3凝胶成像分析电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上成像，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带大小，拍照存档后进行检测分析。B.3.3.4判定规则B.3.3.4.1检测样品出现预期大小目标条带的，判为阳性。B.3.3.4.2检测样品未出现预期大小目标条带的，判为阴性；B.3.3.4.3阳性对照未出现预期大小目标条带的、或阴性对照出现预期大小目标条带的、或空白对照出现预期大小目标条带的，应重新进行RT-PCR检测。_
