1、道昌中华人民共和国国家标准GB 4789.13-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验产气芙膜梭菌检验2012-05田17发布产飞2012-07-17实施中华人民共和国卫生部发布中华人民共和国国家标准食晶安全国家标准食品微生物学检验产气英膜梭菌检验GB 4789. 13-2012 晤中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张O
2、.75 字数17千字2012年7月第一版2012年7月第次印刷* 书号:155066. 1-45324定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB 4789.13一2012目。自本标准代替GB/T4789. 13-2003(食品卫生微生物学检验产气英膜梭菌检验。本标准与GB/T4789. 13-2003相比，主要变化如下:一一修改了标准的中文名称;一一修改了样品制备过程;一一修改了培养基与试剂;修改了操作步骤;一一修改了菌数计算部分;一一增加了附录A。I 食品安全国家标准食品微生物学检验产气芙膜梭菌检验1 范围本标准规定了食品中产气英膜
3、梭菌CClostridium perfringens)的检验方法。本标准适用于食品中产气英膜梭菌的检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下:a) 恒温培养箱:36oC士1oC; b) 冰箱:2oC5 oC; c) 恒温水浴箱:500C士1oC , 46 oC士0.5oC; d) 天平:感量0.1g; e) 均质器;f) 显微镜:10X 100X; GB 4789.13一2012g) 元菌吸管:1mLC具0.01mL刻度)、10mLC具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头;h) 元菌试管:18mmX180 mm; i) 元菌培养皿z直径90mm; j) pH计或p
4、H比色管或精密pH试纸Ek) 厌氧培养装置。3 培养基和试剂3. 1 膜陈-亚硫酸盐-环丝氨酸CTSC)琼脂:见附录A中A.1。3.2 液体硫乙醇酸盐培养基CFTG):见附录A中A.2。3.3 缓冲动力-硝酸盐培养基:见附录A中A.3。3.4 乳糖-明胶培养基:见附录A中A.4。3.5 含铁牛乳培养基z见附录A中A.5。3.6 0.1%蛋白陈水:见附录A中A.603. 7 革兰氏染色液:见附录A中A.7。3.8 硝酸盐还原试剂:见附录A中A.8。3.9 缓冲甘油-氯化铀溶液:见附录A中A.9。4 检验程序产气英膜梭菌检验程序见图101 GB 4789.13-2012 检样25 g(mL)检样+
5、225mLO. 1%蛋白陈水10-10稀释液各1mL+TSC琼脂混合厌氧培养.36 C:t 1 c、20h -24h.黑色菌落计数任选黑色菌落5个，分别接种FTG培养基图1产气英膜梭菌检验程序5 操作步骤5. 1 样晶制备5. 1. 1 样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在20C50C保存;如8h内不能进行检验，应以无菌操作称取25g(mL)样品加入等量缓冲甘油-氯化铀溶液(液体样品应加双料)，并尽快置于一60c 低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。5.1.2 以无菌操作称取25g(mL)样品放入含有225mLO.1%蛋白陈水(女口为5.1.1中冷冻保存样品，室温解冻后，加入200mLO.1
6、%蛋白陈水)的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min2 min;或置于盛有225mLO.1%蛋白陈水的均质杯中，8000 r/min10 000 r/min均质1min2 min，作为1: 10 稀释液。5. 1. 3 以上述1: 10稀释液按1mL加0.1%蛋白陈水9mL制备lO-2 10寸的系列稀释液。GB 4789.13-2012 5.2 培养5.2. 1 吸取各稀释液1mL加入元菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50.C的TSC琼脂(可放置于50c士1.C恒温水浴箱中保温)15mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。5.2.2 上述琼脂平板凝固后，再加10mL冷
7、却至50.C的TSC琼脂(可放置于50.C士1.C恒温水浴箱中保温)均匀覆盖平板表层。5.2.3 待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36c士1.C培养20h24 h。5.2.4 典型的产气英膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。5.3 确证试验5.3. 1 从单个平板上任选5个(小于5个全选)黑色菌落，分别接种到FTG培养基，36.C士1.C培养18 h24 h. 5.3.2 用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气英膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽抱体。如果培养液不纯，应划线接种TSC琼脂平板进行分纯，36.C士1.C厌氧培养20h 24 h，挑取单个典型黑色菌落接种到FT
8、G培养基，36c士1.C培养18h24 h，用于后续的确证试验。5.3.3 取生长旺盛的FTG培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46.C士0.5c水洛中培养2h后，每小时观察一次有元暴烈发酵现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。产气英膜梭菌发酵乳糖，凝固酷蛋白并大量产气，呈暴烈发酵现象，但培养基不变黑。5.3.4 用接种环(针)取FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36.C士1.C培养24h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有元动力。有动力的菌株沿穿剌线呈扩散生长，元动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5mL
9、试剂甲和0.2mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐;如果不出现颜色变化，则加少许铮粉，放置10min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。产气英膜梭菌元动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。5.3.5 用接种环(针)取FTG培养液穿刺接种乳糖-明肢培养基，于36.C士1.C培养24h，观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5.C左右放置1h，检查明胶液化情况。如果培养基是因态，于36C:l: 1 c再培养24h，重复检查明胶是否液化。产气英膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。6 结果与报告6. 1 典型菌落计数选取典型菌落数在2
10、0CFU 200 CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果:a) 只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU 200 CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落;b) 最低稀释度平板的典型菌落数均小于20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落;c) 某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落;d) 某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在20CFU200 CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落;e) 2个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU 200 CFU之间，分别
11、计数2个稀释度平板上的典型菌落。3 GB 4789.13一20126.2 结果计算6. 1计数结果按式(1)计算:(A ) T(n1+0.17zz)d 式中zT一一样品中产气英膜梭菌的菌落数;A一一单个平板上典型菌落数;B一一单个平板上经确证试验为产气英膜梭菌的菌落数;C一一单个平板上用于确证试验的菌落数;nj一一第一稀释度(低稀释倍数)经确证试验有产气英膜梭菌的平板个数;nz一一第二稀释度(高稀释倍数经确证试验有产气英膜梭菌的平板个数;O. 1 稀释系数;d 一一一稀释因子(第一稀释度)。6.3 报告. ( 1 ) 根据TSC琼脂平板上产气英膜梭菌的典型菌落数，按照6.2中式(1)计算，报告
12、每g(mL)样品中产气英膜梭菌数，报告单位以CFU/g(mL)表示才日T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。4 .1 膜朦亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂.1.1 基础成分膜陈大豆陈酵母粉焦亚硫酸铀拧攘酸铁镀琼脂蒸锢水pH7.6士0.2. 1.2 D-环丝氨酸溶液附录A培养基和试剂15.0 g 5.0 g 5.0 g 1. 0g 1. 0g 15.0 g 900.0 mL 溶解1g D-环丝氨酸于200mL蒸锢水，膜过滤除菌后，于4.C冷藏保存备用。. 1.3 制法GB 4789.13-2012 将基础成分加热煮沸至完全溶解，调节pH，分装至U500 mL烧瓶中，每瓶250mL, 121 .
13、C高压灭菌15 min，于50.C士1.C保温备用。临用前每250mL基础溶液中加入20mL D-环丝氨酸溶液，混匀，倾注平皿。.2 滚体硫Z醇酸盐培养基(FTG). 2.1 成分膜蛋白陈15.0 g L-脱氨酸0.5 g 酵母粉5.0 g 葡萄糖5.0 g 氯化铀2.5 g 硫乙醇酸铀0.5 g 刃天青0.001 g 琼脂0.75 g 蒸锢水1 000.0 mL pH7.1士0.2.2.2 制法将以上成分加热煮沸至完全溶解，冷却后调节pH，分装试管，每管1刊omL, 121 .C高压灭菌l臼5m町ln临用前煮沸或流动蒸汽加热1臼5min，迅速冷却至接种温度。5 GB 4789.13一2012
14、A.3 缓冲动力-硝酸盐培养基A. 3.1 成分蛋白陈5.0 g 牛肉粉3.0 g 硝酸饵5.0 g 磷酸氢二铀2.5 g 半乳糖5.0 g 甘油5.0 mL 琼脂3.0 g 蒸锢水1 000.0 mL pH7. 3:l: 0. 2 A.3.2 制法将以上成分加热煮沸至完全榕解，调节pH，分装试管，每管10mL, 121 c高压灭菌15min。如果当天不用，置4.C左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热15min，迅速冷却至接种温度。A.4 乳糖-明胶培养基A. 4.1 成分A.4.2 制法蛋白陈酵母粉乳糖酣红明肢蒸馆水pH7.5士0.215.0 g 10.0 g 10.0 g 0.05 g
15、120.0 g 1 000.0 mL 加热溶解蛋白胖、酵母粉和明胶于1000 mL蒸锢水中，调节pH，加入乳糖和酣红。分装试管，每管10mL，121.C高压灭菌10min。如果当天不用，置4.C左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热15 min，迅速冷却至接种温度。A.5 含铁牛乳培养基A. 5.1 成分6 新鲜全脂牛奶硫酸亚铁(FeS04.7H20) 蒸锢水1 000.0 mL 1. 0g 50.0 mL GB 4789.13-2012 A.5.2 制法将硫酸亚铁溶于蒸馆水中，不断搅拌，缓慢加入1000mL牛奶中，混匀。分装大试管，每管10mL, 118.C高压灭菌12min。本培养基必须新
16、鲜配制。A.6 0.1%蛋白脏水A. 6.1 成分A.6.2 制法蛋白陈蒸锢水pH7.0士0.2加热溶解，调节pH，121.C高压灭菌15min。A.7 草兰氏染色液A. 7.1 结晶紫染色液A. 7.1.1 成分结晶紫95%乙醇1%草酸镀水榕液A. 7. 1. 2 制法将结晶紫完全溶于乙薛中，然后与草酸镀溶液混合。A.7.2 革兰氏破液A. 7. 2.1 成分A. 7. 2. 2 制法腆腆化饵蒸懵水1. 0g 1 000.0 mL 1. 0g 20.0 mL 80.0 mL 1. 0g 2.0 g 300.0 mL 将腆与腆化饵先混合，加入蒸馆水少许振摇，待完全溶解后，再加入蒸馆水至300m
17、L。A.7.3 沙黄复染液A. 7.3.1 成分沙黄95%乙醇蒸锢水0.25 g 10.0 mL 90.0 mL NFON-2.mh叮阁。GB 4789.13-2012 制法A. 7. 3. 2 将沙黄溶解于95%乙醇中，然后用蒸锢水稀释。染色方法涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。滴加革兰氏腆液，作用1min，水洗。滴加95%乙醇脱色约15s30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。滴加沙黄复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。A.7.4 硝酸盐还原试剂A.8 甲灌(对氨基苯璜酸溶灌)A.8.1 在1000 mL 5 mol/L乙酸中溶解8g对氨基苯磺酸。Z渡(-荼酣Z酸溶渡)A.8.2 在1000 mL 5 mol/L乙酸中溶解5g a-荼醋。缓冲甘油-氧化铀溶液A.9 100.0 mL 4.2 g 12.4 g 4.0 g 900.0 mL 甘油氯化铀磷酸氢二饵(元水)磷酸二氢饵(元水)蒸锢水pH7.2士0.1成分A.9.1 制法将以上成分加热至完全溶解，调节pH，121c高压灭菌15mino配制双料缓冲甘油溶液时，用甘油200 mL和蒸锚水800mL。A.9.2 侵权必究书号:155066 1-45324 定价:司k版权专有16.00 GB 4789.13-2012 打印日期:2012年7月23日F002
