1、ICS 13.020 C 51 国盟中华人民共和国国家标准GB 7959-2012 代替GB7959-1987 粪便无害化卫生要求Hygienic requirements for harmless disposal of night soil 2012-11-20发布2013-05-01实施五忡崎/内hu略地/-3 中华人民共和国卫生部也士中国国家标准化管理委员会。叩GB 7959-2012 目次前言I1 范围.2 规范性引用文件-3 术语和定义4 粪便处理的卫生要求.5 监督监测.6 监测检验方法附录A(规范性附录)高温堆肥湿度测定方法附录B(规范性附录)粪便水分含量测定法附录C(规范性附
2、录沙门氏菌属检测法附录(规范性附录堆肥、粪稀中粪大肠菌群检测法.附录E(规范性附录蛐虫卵检查法附录F(规范性附录)粪稀钩虫卵检查法.20 附录G(规范性附录)粪稀中血吸虫卵检查法.附录H(规范性附录)蠕虫卵死活鉴别方法.附录1(规范性附录)蚊、蝇的密度监测方法.34 前本棋准的全部技术肉窑为强制性。本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准代替GB7959一1987(粪便无害化卫生标准儿本标准与GB7959-1987相比主要变化如下zGB 7959-2012 一一依据GB/T1. 1-2009(标准化工作导则第1部分z标准的结构和编写规则调整了结构，对标准中的文字部分作了全面修
3、改z一一补充了术语和定义，如粪便无害化处理、粪大肠菌值等z一一按好氧、厌氧与兼性厌氧发酵、密闭贮存、粪尿分集于式粪便处理和固液分离絮凝-脱水处理方法的类别，分别提出了卫生要求z一一本标准所指粪便元害化，涉及减少、去除或杀灭粪便中的肠道致病菌、寄生虫卵等生物性致病因子，强调农业资源化利用与土地处理是粪便深度处理的组成部分z一一明确了进行粪便处理运行监管部门和卫生监督检测部门的责任s一一修改并增加了与本标准配套监测检验方法的部分内容。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准负责起草单位z中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所。本标准参加起草单位z四川省疾病预防控制中心、河南省疾病预防控
4、制中心、重庆市疾病预防控制中心。本标准主要起草人z王俊起、王友斌、潜力军、张本界、田洪春、孙凤英、韩克勤、汪新丽、谢红、潘顺昌。I GB 7959-2012 粪便无害化卫生要求1 范围本标准规定了粪便无害化卫生要求限值和粪便处理卫生质量的监测检验方法。本标准适用于城乡户厕、粪便处理厂(场)和小型粪便无害化处理设施处理效果的监督检测和卫生学评价。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。GB 18918 城镇污水处理厂污染物排放标准CJJ/T 30 城市粪便处理厂运行
5、、维护及其安全技术规程CJJ 64 粪便处理厂设计规范消毒技术规范卫生部3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 粪便excre钮，nightsoil 人体排泄的粪和尿，统称为粪便。3.2 粪便无害化处理h町mI四sdi暗由aIof night soil 减少、去除或杀灭粪便中的肠道致病菌、寄生虫卵等病原体，能控制蚊蝇草生、防止恶臭扩散，并使其处理产物达到土地处理与农业资源化利用的处理技术。3.3 好氧发酵aerobic fennentation 高温堆肥thermophilic composting 采用人工与机械堆积的方式，在有氧条件下，经微生物作用，使粪便和生活垃圾等有机物，温
6、度达到50 c及以上并能维持一定时间的处理方法。3.4 厌氯消化anaerobic fennentation 粪便有机物在厌氧条件下，依专性厌氧菌使粪便中的有机物降解并产生泪气的处理方法，其处理设施包括高温、中温和常温沼气消化处理池。3.5 兼性厌氧发酵facnltative anaerobic fennentation 依兼性厌氧菌使粪便中的有机物降解的处理方法，其处理设施包括三格化粪池、双瓮化粪池。1 GB 7959-2012 3.6 羹大肠菌值valu四offecal coliforms 检出一个粪大肠菌菌落形成单位的最小样本量，系评价粪便元害化效果的重要卫生指标，菌值越大表明处理效果越
7、好.3. 7 消毒disinfection 减少、去除或杀灭粪便中的病原微生物使达到无传播危害的处理技术。4 粪便处理的卫生要求4. 1 城乡采用的粪便处理技术，应遵循卫生安全、资源利用和保护生态环境的原则。4.2 对粪便必须进行无害化处理，严禁未经无害化处理的粪便用于农业施肥和直接排放。4.3 粪便处理厂设计应符合J64的规定。采用固液分离-絮凝脱水处理法处理粪便时，产生的上清液应与污水处理厂污水合并处理，污泥须采用高温堆肥等方法处理。处理后最终的排放出水，其总氮、总磷等富营养化物质含量应符合GB18918要求。4.4 应有效地控制蚊、蝇草生。使堆肥堆体、贮粪池与厕所周边无存活的姐、蝠和新羽
8、化的成蝇。4.5 清掏出的贮粪地粪渣、粪皮，沼气池沉渣、各类处理设施的污泥，应经高温堆肥元害化处理合格后方可用作农业施肥。4.6 肠道传染病发生时，应对粪便、贮粪池及粪便可能污染的场所、容器等进行消毒，消毒方法与消毒剂应用应参照消毒技术规范的要求执行。4.7 经各种方法处理后的粪便产物应符合表1表4的卫生要求。表1好氧发酵(高温堆胆的卫生要求编号项目E生要求人工堆温;:50c ，至少持续10d 1 温度与持续时间堆温二注60C，至少持续5d 、, 、机械堆温;:50C，至少持续2d2 翩虫卵死t直在二注9SYo/ / 3 粪大肠菌值注10-24 沙门氏菌不得检出L-画画表2厌氧与兼性厌氧消化的
9、卫生要求编号项目E生要求常温厌氧消化注30d 户用型兼性厌氧发酵主主30d 1 消化温度与时间常温厌氧消化注10c 二注20d 工程型中温厌氧消化35 c 二注15d 高温厌氧消化55 c 二主8d常温、中温厌氧消化沉降率二注95%2 姻虫卵高温厌氧消化死亡率二三95%2 GB 7959-2012 表2(续)编号项目卫生要求3 血吸虫卵和钩虫卵a不得检出活卵中湿、常温厌氧消化;:;:10-4 4 粪大肠菌值高温厌氧消化;:;:lO-z 兼性厌氧发障二注10-45 沙门民菌不得检出a在非血吸虫病和钩虫病流行区，血吸虫卵和钩虫卵指标免检.表3密封贮存处理的卫生要求编号项目卫生要求1 密封贮存时间不
10、少于12个月2 烟虫卵死亡率二注95%3 血吸虫卵和钩虫卵不得检出活卵4 粪大肠茵值注10-45 沙门氏菌不得检出表4脱水干燥、粪尿分集处理粪便的卫生要求编号项目卫生要求尿及时应用z疾病流行时，不少于10da 1 贮存时间草木灰混合2个月，粪细沙混合6个月，煤灰、黄土混合12个月2 蝠虫卵死亡率;:;:95% 3 血吸虫卵和钩虫卵不得检出活卵4 粪大肠菌值注10-25 沙门氏菌不得检出6 pH 草木灰、粪混合后pH97 水分50%以下a按卫生行政部门的要求执行.5 监督监测5. 1 粪便处理厂应按照CJJ/T30的规定进行日常运行监测。5.2 相关部门应定期进行粪便处理效果的监督监测和卫生学评
11、价。3 GB 7959-2012 6 监测栓验方法6. 1 高温堆肥温度测定方法见附录A.6.2 粪便水分含量测定法见附录B.6.3 沙门民菌检测法见附录c.6.4 堆肥、粪稀中粪大肠菌群检验法见附录D。6.5 蛐虫卵检查法见附录E.6.6 粪稀钩虫卵检查法见附录F.6.7 粪稀中血吸虫卵检查法见附录G6.8 蠕虫卵死活鉴别方法见附录H.6.9 蚊、蝇的密度监测方法鬼附录1./ / / 4 GB 7959-2012 附录A(规范性附录富温堆肥温度测定方法A.1 适用范围适用于高温堆肥堆体内温度的测定。A.2 温度要求堆体好氧发酵过程中，保持50c以上的温度，是评定粪便无害化效果的重要指标。A.
12、3 仪器选择金属套筒温度计或热敏数显测温装置。A.4 测定方法A.4.1 测点z堆体的上、中、下三层，各层测量堆体距表面10cm与中心部位两个测点。A.4.2 待温度恒定后，读数记录。A.4.3 在堆棋周期内应每天测试各测试点温度。5 GB 7959-2012 附录B(规范性附录)粪便水分含量测定法B. 1 适用范围适用于脱水干燥、干式贮存粪便水分含量的测定。B.2 温度要求粪便样品在(105士2)C烘至恒重时的失重，即为粪便样品所含水分的质量。B.3 仪器、设备B.3.1 金属铲。B.3.2 土壤筛z孔径1mm. B.3.3 铝盒z小型的直径()约50mm，高约20mm. B.3.4 天平z
13、感量为0.001g。B.3.5 电热恒温烘箱。B.3.6 干燥器z内盛变色硅胶或元水氯化钙。B.4 试样的选取和制备用金属铲在贮粪池取有代表性的粪样，刮去上部浮物，将金属铲至所需深度处，取粪便样品约10g , 迅速装人已知准确称量的铝盒内，盖紧并将铝盒外表擦拭干净，待测定。应做平行样。B.5 测定步骤将盛有粪便的两份平行样品铝盒分别在分析天平上称量，准确至0.01g。揭开盒盖，放在盒底下，置于已预热至(105士2)C的烘炜箱中烘烽12h。取出后立即盖紧，在于燥器中冷却至室温(约需30 min) ，再称重。样品在烘箱内应干燥至恒重(烘烽规定时间后一次称量)，使两次称量差值不超过试样质量的3%。B
14、.6 测定结果的计算B. 6.1 计算公式=湿重计算方法见公式(B.l)式中=w湿湿重，%; 6 W樱=生二旦旦X100% ml-mO ( B. 1 ) mo一一烘于空铝盒质量，单位为克(g);ml一一烘干前铝盒及土样质量，单位为克(g); mz一一烘干后铝盒及土样质量，单位为克(g)。干重计算方法见公式(B.2)式中zw于一一干重，%; 切平=巴二旦旦X100% mz-mo mo一一烘干空铝盒质量，单位为克(g);ml一一烘干前铝盒及土样质量，单位为克(g);mz一一烘干后铝盒及土样质量，单位为克(g)。8.6.2 平行测定的结果用算术平均值表示，保留小数点后一位。G8 7959-2012
15、( B.2 ) 7 GB 7959-2012 C. 1 适用范围附录C(规范性附录)沙门氏茵属栓测法适用于未经处理或无害化处理后粪便、粪液和堆肥中的沙门民菌测定。C.2 检测指标抄门氏菌属是人类和动物常见的一组肠道致病菌，是肠道传染性疾病流行时，评价粪便无害化处理效果的主要指标。C.3 设备和材料C.3.1 设备天平、乳钵或均质器、恒温培养箱(36士1)c，(44士0.5)c、水浴箱、显微镜、冰箱、高压蒸汽灭菌器、pH计或精密pH试纸、平皿、刻度吸管、试管、玻片、接种环针)、采样瓶、锥形瓶。C.3.2 培养基和试剂C. 3.2.1 样晶稀释渡氯化铀蒸锢水8.5 g 1000 mL 制法z将上述
16、成分溶解于蒸锢水中，分装到加玻璃珠的锥形瓶内，每瓶90mL, 121 C, 20 min高压蒸汽灭菌，C.3.2.2 双倍料缓冲蛋白臆水(BP)蛋白陈氯化铺磷酸氢二铀(NazHPO. 12HzO) 磷酸二氢饵(KHzPO.)蒸锢水20 g 10 g 18 g 3g 1000 mL 制法z将上述成分溶解于蒸锢水中，调节pH7.2，分装到内有玻璃珠的锥形瓶中，每瓶100mL, 121 C, 15 min高压蒸汽灭菌。C.3.2.3 氧化镶孔雀绿增菌擅(MM)C. 3. 2. 3. 1 甲灌8 膜蛋白陈氯化铀5 g 8 g 磷酸二氢饵蒸锢水1. 6g 1000 mL 制法z将上述成分溶于蒸锢水中，1
17、21C, 15 min高压蒸汽灭菌，为甲液。C. 3. 2. 3. 2 Z擅氯化镜蒸锢水40 g 1000 mL 制法z将上述成分蓓于蒸馆水中，121C, 15 min高压蒸汽灭菌，为乙液。C.3.2.3.3 丙液孔雀石绿榕液(4g/L) GB 7959-2012 制法z取甲液90mL，乙液9mL和丙液2.7mL，以无菌操作混合即成氯化镜孔雀绿增菌液(MM), 分装无菌试管，每管9mL。C.3.2.4 亚硫酸铿琼脂(BS)蛋白陈牛肉膏葡萄糖硫酸亚铁(FeS04 7Hz 0) 磷酸氢二锅(Na2HP04 12H20) 孔雀石绿拧攘酸锚镀Bi(NH4)3(C6 Hs 07)2 HzO 亚硫酸铀(N
18、a2S03)琼脂蒸锢水10 g 5g 5 g 0.3 g 4g 0.025 g 2g 6 g 18 g20 g 1000 mL 制法z将上述前5种成分榕解于300mL蒸锢水中，将拧攘酸锚镜和亚硫酸铀另用50mL蒸锢水溶解。将琼脂于600mL蒸馆水中煮沸溶解，冷却至80c。将以上三液合井，补充蒸馆水至1000 mL，调至pH7.5，加入5mL孔雀石绿溶液(5g/L)，摇匀。冷却至50c 55 C，倾注平皿备用，平板呈淡绿色。注s此培养基不需高压灭菌，制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性，应在临用前1d制备，贮存于室温暗处，超过48h不宜使用.C.3.2.5 SS琼脂C. 3. 2. 5.1 基
19、础培养基牛肉膏际陈胆盐(三号琼脂蒸锢水5g 5g 3.5 g 17 g 1000 mL 制法z将牛肉膏、际陈和胆盐溶解于400mL蒸锢水中，将琼脂加入于600mL蒸馆水中，煮沸使其榕解，再将两液提合，121C, 15 min高压蒸汽灭菌，备用。9 GB 7959-2012 C.3.2.5.2 完全培养基基础培养基乳糖拧攘酸锅(Na3C6Hs07.2H20)硫代硫酸铀(Na2Sz03.5H20) 1000 mL 10 g 8.5 g 8.5 g 拧攘酸铁溶液(Na3C6Hs07 2H20) (100 g/L) 10 mL 中性红禧液(10g/L) 2.5 mL 孔雀石绿禧液(1g/L) O. 3
20、3 mL 制法z加热榕化基础培养基，按比例如入上述染料以外的各成分，充分混匀，调至pH7.0，加入中性红和孔雀石绿溶液，混匀后倾注平板。注，制好的培养基宜当日货用，或保存于冰箱内于48h内使用.孔雀石绿溶被配好由应在10d以内使用。C.3.2.6 三糖铁蹦叩寸丁斗蛋白脏20 g 牛肉膏5 g 乳糖10 g 蔚糖10 g 葡萄糖1 g 氯化销5g 硫酸亚铁镀【NH4)2S0 FeSO6H20 0.2 g 硫代硫酸铀(Na2S203.5H20) 0.2 g 琼脂12 g 酣红0.025 g 蒸锢水lo mL 制法z将上述除琼脂和酣红以外的各成分溶解于蒸锢水中，调至pH7.40加入琼脂，加热煮沸禧化
21、。加人5mL酷红Gg/L摇匀，分装试管，115c , 20 min高压蒸汽灭菌放置高层斜面备用。 ， C.3.3 革兰民染色、，, C. 3. 3.1 革兰氏染灌 C.3.3.1.1 结晶紫染渡结晶紫1 g 乙障(C2HsOH)=95%20 mL 草酸镀(NH4)2C204J溶液(10g/L) 80 mL 制法z将结晶紫需解于乙蹲中，与草酸镀染液混合。C.3.3.1.2 革兰民确溃腆片腆化饵蒸锢水1 g 2g 300 mL 制法z在腆化挥中加入少许蒸锢水溶解后，加入映片充分振摇，再补足蒸馆水至300mL. C.3.3.1.3 脱色剂乙醇(C2HsOH)=95%JC.3.3.1.4 沙黄复染擅沙
22、黄0.25 g 乙醇(C2HsOH)=95%J10 mL 蒸锢水90 mL 制法z将沙黄榕解于乙醇中，待完全溶解后加人蒸锢水。C. 3. 3.2 染色法将18h-24 h的培养物涂片。将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗，滴加革兰氏腆液，作用1min，水洗。滴加脱色剂，摇动玻片，直至元紫色脱落为止，约30s，水洗。滴加复染剂，复染1min，水洗，待干，镜检。C.3.4 沙门氏菌属因子诊断血清C.4 检验步骤C.4.1 样晶采集、制备C. 4. 1. 1 样晶采集GB 7959-2012 C. 4. 1. 1. 1 粪便样品采集z用无菌铲(勺采集粪便样品，在5个以上的采样点共采
23、取约500g，置元菌广口瓶内备检。C.4. 1. 1. 2 堆肥样品采集z堆肥的表层(距表面10cm以上和中层断面各采集三点，用无菌慑子拣出样品中石块、木屑、玻璃等块状物，充分混合后取约500g. C. 4. 1. 1. 3 粪稀样品采集z用元菌采样器、蠕动泵等，在三格化粪池、双瓮池、泪气池相应部位，采集贮粪池、沼气池内样品，样品量约500mL，置元菌广口瓶内备检。C.4. 1. 2 样晶制备C.4.1.2.1 固态样品E将样品置于元菌瓷盘内，充分混匀称取10g样品，放人带有玻璃珠的元菌锥形瓶内，加人9omL生理盐水(8.5g/L) ，混摇3min卢【.、斗、C巳.4.1. 2. 2 粪稀等样
24、品，取混摇均匀的粪稀10g或粪稀液10mL，置于带有玻璃珠的元菌锥形瓶内，加人9omL生理盐水(8.5g/L) ，混摇3min-5 min，制成混悬液。C.4.2 前增菌以无菌操作，取制备的混悬液10mL接种到90mL缓冲蛋白陈水(BP)中，混匀，置(36士1)C培养(18士2)h.C.4.3 选择性增菌用无菌吸管吸取1mL增菌液加入到9mL氯化镜孔雀绿增菌液(MM)中，置(44士0.5)C培养24 h-48 h. 11 GB 7959-2012 C.4.4分离用接种环分别取选择性增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸锚琼脂平板(BS)和一个SS琼脂平板，于(36士1)C培养24h-48 h.观察各
25、个平板上生长的菌落。沙门民菌在亚硫酸钻琼脂平板上的菌落特征为，产H2S菌落为棕褐色或灰色至黑色，有时有金属光泽，周围培养基呈棕色或黑色，不产H2S菌株呈灰绿色，周围培养基不变或徽变暗;沙门民菌在SS琼脂平极上的菌落特征为，元色半透明F产HzS菌株菌落中心带程度不同的黑色F乳糖阳性菌株为粉红色中心黑色。若各选择性平板上无可疑菌落生长，可直接报告未检出沙门氏菌。C.4.5 生化试验自选择性琼脂平板上用接种纤直接挑取可疑菌落，分别接种三糖载剧旨斜面上，尽可能多的选择可疑菌落，少于5个菌落的平板，应全部挑取。置(36士1)C培养uhr:- 48 h观察结果。在三糖铁琼脂上，凡生化反应特征符制面为红色、
26、高层变黄，少量或中等程度产气，严飞不产2S者，应继续进行血清学鉴定实验，全部始机构色者弃之。二、/ C.4.6 革兰氏染色/二/取三糖铁琼脂可疑阳性的斜面菌苔，涂片进行革兰氏染色，显微镜下镜检应为革兰民阴性短杆菌。C.4.7 血清学鉴定用沙门氏菌因子血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。C.5 结果报告C. 5.1 综合上述生化试验和血清学鉴定的结果，符合抄门氏菌属特征的确认检出盼门民菌，并报告为检出沙门氏菌飞飞C.5.2各选择性平板上无可疑菌落生长，或检出可疑菌落而生化试验和血清学鉴定不符合者，报告未检出沙门氏菌。、飞 , / / 12 GB 7959-2012 附录D规范性附录)堆肥、
27、羹稀中羹大肠菌群栓测法D.1 适用范围适用于堆肥、粪稀中粪大肠菌群测定。D.2 温度要求粪大肠菌群系指一群需氧和兼性厌氧，在44.5c生长，发酵乳糖并在24h48 h内产酸产气的革兰氏阴性无芽抱杆菌。依粪大肠菌值，评价粪便元害化处理效果。D.3 设备和材料D.3.1 设备恒温培养箱:(36士1)C、(44士0.5)C、高压蒸汽灭菌器、显微镜、冰箱4C、接种环、电磁炉、锥形瓶、试管、小倒管、pH计或精密pH试纸、温度计、灭菌吸管(10mL、1mL)、灭菌平皿直径(d)90 mmJ、载玻片、接种环。D.3.2 培养基和试剂D. 3. 2. 1 乳糖胆盐培养基D. 3. 2. 1. 1 成分za)
28、蛋白陈b) 猪胆盐或牛、羊胆盐c) 乳糖d) 澳甲酣紫水溶液(4g/L) e) 蒸馆水20 g 5 g 10 g 2.5 mL 1000 mL D. 3. 2. 1. 2 制法z将a)-c)加人蒸馆水中榕解，调pH到7.2-7.4，加d)，混匀，分装至带有小发酵倒管的试管内，每管10mL. 115 c , 20 min灭菌。如需要二倍浓缩培养基，将上述成分a)d)的用量加倍，蒸铺水量不变，配制即成。复发酵用乳糖发酵管，减除上述培养基成分中的胆盐即可。D.3.2.2 晶红亚硫酸铀培养基D. 3. 2. 2.1 成分=a) 蛋白脏b) 酵母浸膏c) 牛肉膏d) 磷酸氢二伺(K2HP04) d 乳糖
29、f) 亚硫酸铀(Na2S03)10 g 5 g 5 g 3.5 g 10 g 5 g 13 GB 7959-2012 g) 琼脂h) 碱性品红乙薛溶液(50g/L) i) 蒸锢水D.3.2.2.2 制法15 g20 g 20 mL 1000 mL D. 3. 2. 2. 2. 1 将琼脂加入到500mL蒸锢水中，煮沸溶解，于另500mL蒸锢水中加入a)-d)，加热榕解后与已溶解的琼脂混匀，调pH为7.2-7.4，加人乳糖，分装，115C, 20 min高压蒸汽灭菌。即成基础培养基，储存于冰箱4C备用。D.3.2.2.2.2 将亚硫酸铀用少许元菌蒸锢水禧解，沸水浴中煮沸10min，用灭菌吸管滴加
30、上述碱性品红乙薛榕液，至淡粉红色。将此混合液加人上述基础培养基中，充分混匀，倾注灭菌平皿。不能及时使用可置冰箱4C避光保存备用，但不宜超过两周，如培养基成为深红色，则不能应用。D.3.2.3 伊红美蓝(EMB)琼脂D. 3. 2. 3. 1 成分蛋白陈乳糖磷酸氢二饵(KaHP04)琼脂伊红榕液(20g/L) 美蓝溶液(5g/L) 蒸馆水D. 3. 2. 3.2 制法10 g 10 g 2 g 20 g 20 mL 13 mL 1000 mL 将琼脂加到500mL蒸锢水中加热溶解，另取适量蒸馆水加人磷酸氢二饵、蛋白陈，混匀溶解，两液混合，补充蒸懦水至1000mL，校正pH为7.27. 4，分装于
31、锥形瓶内，121C, 15 min灭菌备用。用前融化琼脂并加人乳糖，混匀冷至50C -55 C，元菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀倾注平皿备用。品红亚硫酸锅培养基与伊红美蓝(EMB)琼脂可任选其中一种。D.3.2.4 革兰民染色同附录C.4.6。D.3.2.5 样晶稀释擅氯化铀8.5 g 蒸馆水1000 mL 制法z将上述成分溶解于蒸锢水中，分装到加玻璃珠的锥形瓶内，每瓶90mL，或按需要分装到试管中，121C, 20 min高压蒸汽灭菌。D.4 操作步骤D.4.1 样晶采集、制备同附录C.4. 1. 1. 14 GB 7959-2012 D.4.2 样晶接种D. 4. 2.1 根据样品污染
32、程度决定稀释度，避免样品接种结果均呈阳性或阴性。用元菌吸管吸取1: 10 样品混悬液1mL加到含有9mL灭菌生理盐水的试管中，制成1I 100稀释液，由1: 100稀释液管中用元菌吸管吸取1mL加到含有9mL灭菌生理盐水的试管中，制成1: 1 000稀释液，按同法依次稀释，制成1: 10000、1: 100 000等梯度稀释液。D.4.2.2 初发酵试验z分别用1mL灭菌吸管吸取1: 10、1: 100、1: 1 000、1: 10 000等稀释液各1 mL，分别接种于乳糖胆盐发酵管内，置(44士0.5)c培养箱中培养24h(接种量为10mL时，可用与接种量相等的双料乳糖胆盐发酵管。D.4.2
33、.3 分离培养z将经培养24h后，产酸产气或只产酸的发酵管，用接种环分别取发酵液，划线接种于碱性晶红亚硫酸销琼脂或伊红美蓝琼脂平板，置(36士1)C培养24h。D.4.2.4 染色镜检z用接种环挑取所使用培养基上生长的粪大肠菌可疑菌落的一小部分，进行革兰氏染色，镜检。D.4.2.5 复发酵试验z经革兰氏染色，镜检为革兰民阴性无芽抱杆菌，挑取该可疑菌落的另一部分接种乳糖发酵管，置(44士o.5) c培养箱中培养24h，如产酸产气，即证实有粪大肠菌群存在。D.5 结果报告D.5.1 根据证实为粪大肠菌群的阳性发酵管数，查表D.1粪大肠菌值表，报告样品粪大肠菌值/g(或mL)。D.5.2 由于表D.
34、1是按一定的四个10倍浓度差接种量设计的(粪稀接种量为10mL, l mL、0.1mL 和0.01mL，粪便污泥接种量为19、0.1g、0.01g和0.001g)，当采用其他四个10倍被度差接种量时，需要修正表D.1中值，具体方法如下=D.5.3 表内所列粪稀(粪便污泥最大接种量增加或减少10倍时，表D.1的粪大肠菌值相应增加或减少10倍。如粪稀接种量改为10mL、1mL、0.1mL和0.01mL，表D.1的粪大肠菌值相应增加10倍。其他的四个10倍浓度差接种量的粪大肠菌值相应类推。表D.1羹大肠菌值囊样品接种量/g(或mL)菌值10 1 0.1 0.01 11.1 + 11. 1 + 11.
35、 1 十10.5 + 十5.6 + + 5.3 + + 4.6 + 4.3 + + + 3.6 + + 十1. 1 15 GB 7959-2012 表D.1 (续样品接种量/g(或mL)菌值10 1 0.1 0.01 + + 1. 0 + 十十0.6 + + 0.4 十+ + 0.1 十+ + 0.04 十十+ + 0.04 注z一表示阴性醇管.十表示阳性发醇管.16 , E. 1 堆肥蛐虫卵的栓查E. 1. 1 饱和硝酸铀漂浮法E. 1. 1.1 方法原理附录E(规范性附录)蛐虫卵检查法GB 7959-2012 经碱性潜液处理使蛐虫卵从堆肥、粪便样品中分离，用饱和硝酸铀榕液将烟虫卵漂浮，收集
36、漂浮的蛐虫卵镜检，计数样品中的蛐虫卵个数。E. 1. 1. 2 设备与试剂E. 1. 1.2. 1 设备z离心机、电动振荡机、离心管(50mL)、橡皮塞子、玻璃珠、金属丝圈、光学显微镜、铜筛(3mm)、铜筛(2mm)、滤器、漏斗、火棉胶滤膜、抽滤设备、毒盘、慑子、眼科弯头小镇子E. 1. 1. 2. 2 试剂z氢氧化锅溶液(50g/L) ，饱和硝酸铀溶液。福尔马林溶液(HCHO)=3%)，盐酸溶液(30g/L)。E. 1. 1. 3 栓验步骤E. 1. 1. 3. 1 样品采集:(同附录C.4.1.口。E. 1. 1.3.2 样品预处理z将样品倒于瓷盘内，压碎该样品中较大的土颗粒，先后用孔径3
37、mm的铜筛和孔径2mm的铜筛过筛，收集过筛后的样品。备检样品量不少于100g.多含大量腐烂蔬叶、瓜果皮和草梗等纤维的堆肥样品，采用沉淀法。E. 1. 1. 3. 3 分离虫卵z取过筛样10g，放人50mL清洁离心管中，加人35mL40 mL氢氧化铺溶液(50 g/L)至刻度线，另加玻璃珠约10粒，用适当大小的橡皮塞紧塞管口，置电动振荡机上，振荡10min 15 min，转速200r/min300 r/min，静置15min30 min后，再行振荡，如此重复3次4次，使蛐虫卵与堆肥分离。E. 1. 1.3.4 漂浮虫卵z取下离心管，揭去橡皮塞子，用清水将附着在皮塞上和管口内壁的泥状物冲人管中，2
38、000 r/min2 500 r/min离心3min-5 min，倒去氢氧化铀禧液，加清水将沉淀物搅浑后，2 000 r/min2 500 r/min离心3min5 min，倒去液体，加水漂洗，直到清洗透明为止。加人饱和硝酸销溶液(密度1.38 g/ mL 1. 40 g/ mL) ，用玻璃棒搅成糊状后，徐徐添加饱和硝酸铀溶液，随加随搅，直加到离管口约10mm处，用一两滴饱和硝酸铀禧液清洗玻棒并收集于管中，2000r/min 2500 r/ mln离心3min5 min. E. 1. 1. 3. 5 虫卵收集za) 捞取法z用直径10mm的金属圈，将表层液膜移于盛有半杯清水的小烧杯中，约捞取3
39、0次后。重复虫卵分离、漂浮操作，适当增加一些饱和硝酸锅溶液，如此反复操作3次4次，直到液膜涂片未查见虫卵为止，b) 藉贴法z在饱和硝酸铀溶液满至管口处，覆上18mmX18 mm盖玻片。静置15min后，取下盖玻片置于载玻片上镜栓，反复3次，直到未查见虫卵为止。E. 1. 1. 3. 6 抽滤z将烧杯中含卵液通过直径35mm微孔火棉肢滤膜(孔径。.65mO.80m)抽滤。一张滤膜不能滤过全部液体时，可另取滤膜过滤.17 GB 7959-2012 E. 1. 1. 3.7 镜检z用眼科弯头慑子，将撞膜取下，平铺于40mmX75 mm载物玻璃片上，滴加二、三滴50%甘油溶液进行透明，低倍显微镜下镜栓
40、和计数。E. 1. 1.4 样晶保存待检堆肥样品，需滴加福尔马林溶液(HCHO)=3%)或盐酸溶液(30g/L)少许，加盖放置冰箱保存。E. 1. 1.5 结果报告方式计数虫卵数注150个，并计算报告死亡率p捡出蛐虫卵数小于150个，报告检出蛐虫卵总数与死、活虫卵个数。E. 1.2 沉淀法E. 1.2. 1 适用条件粪便样品、不具备滤膜捷器设备或多含大量腐烂蔬叶等纤维的堆肥样品，采用沉淀法检测其烟虫卵数。E. 1. 2. 2 设备与试剂E. 1. 2. 2. 1 设备z剪刀、锥形瓶、量杯。000mL)、刻度量筒、橡胶塞、玻璃珠、光学显微镜、铜筛(3 mm)、铜筛(2mm)、载玻片。E.1.2.
41、2.2 试剂z氢氧化铀溶液(50g/L).饱和硝酸铀榕液。E. 1.2.3 栓验步骤E. 1. 2. 3. 1 样品采集(同C.4.1.1)。E. 1. 2. 3. 2 样品预处理z样品用剪刀剪小，清水浸泡，继将洗液静置沉淀，而后收集100mL沉淀物备检。E. 1. 2. 3. 3 水洗z量取50mL-100 mL堆肥或粪便的浸出沉淀物，放在500mL锥形瓶中，加人100 mL150 mL氢氧化铀蓓液(50g/L)和三四十粒玻璃珠，塞以橡皮塞。浸泡30min后，振摇3时n-4 min.将上面的液体，倒入大烧杯中，再加等量清水于锥形瓶中，清洗34次，直到洗出液透明为止。E. 1. 2. 3. 4
42、 过滤z将收集的洗液，用1-2层纱布过滤于1000mL量杯中，静置0.5hl h后，倒去上层液体，如此，约30min换水一次，直至上层水澄清为止。E. 1.2.3.5 测定体现z用虹吸管吸去上层液体，将沉淀物倒人刻度量筒中，准确测量沉淀物的容坝。E. 1. 2. 3. 6 镜检z将沉淀物搅拌均句，用1mL吸管取0.05mL和0.1mL样品于载玻片，盖以盖玻片，在低倍镜下镜检并计数。E. 1.2.4 结果报告连续观察3次，取其平均数，计算1mL沉淀物的虫卵数，最后乘以沉淀总容权数，便是100g原始堆肥样品的虫卵数。样片中虫卵数注150个，应按死亡率报告F样片中虫卵数150个，分别报告实际虫卵总数
43、与死、活虫卵个数。E.2 羹稀蝠虫卵的检查E.2.1 粪稀浓缩法取出料口粪稀，样品量可达5000mL.分别用250m铜筛过滤于量杯中，让其自然沉淀1h.倒去GB 7959-2012 上层液体，另换清水搅挥，静置沉淀，反复水洗沉淀，至沉渣上面的水接近澄清后，弃去上清液。将沉渣倒人100mL量筒中，测量沉渣的容飘。经充分搅拌后，用1mL玻璃吸管，迅速吸取沉渣0.1mL于载玻片上，盖以盖玻片镜检。E.2.2 司氏法E. 2. 2.1 将定量(质量或容积均可)的稠粪样品，稀释为定量的稀释液，经混合均匀后，从中再吸出一定量的稀释液，在显微镜下，计数其中含有的蛐虫卵。然后按稀释的倍数，计算出该稀释液中的卵
44、数，最后换算成单位重量或容积原样品中含有的蛐虫卵数。E.2.2.2 用一支100mL硬质玻璃试管，在容水45mL处作一标志或刻度。E.2.2.3 称取3g搅句的粪稀样品，装入试管中，注人氢氧化铀溶液c(NaOH)=0.1 mol/LJ的至45 mL标志或刻度处，另加十余粒玻璃珠。E.2.2.4 用橡皮塞子紧塞管口后，极力振摇，使成均匀的混合液为止。如样品中含有粪块，应放置过夜，使有足够的消化时间。E.2.2.5 在计数前再把它摇匀。摇后速用1mL刻度吸管，吸取混合液0.15mL于大型载物片(37 mm-75 mm)上，盖以22mmX40 mm的盖玻片(如缺大载物片，则将吸出的0.15mL混合液
45、分别滴于2-3张一般大小的载物片上，盖以10mmX18 mm的盖玻片亦可。E.2.2.6 然后在低倍显微镜下数完0.15mL混悬液中所有的烟虫卵数，将所数得的卵数乘以100，即为每克粪稀中所含有的烟虫卵数。如样品稍稀，不用玻璃试管，改用100mL锥形瓶亦可，在容积60mL处，刻一刻度，取混匀的粪稀样品4mL于此刻度烧瓶中，注人氢氧化铀禧液c(NaOH)=0.1 mol/日，至60mL刻度处，再放人十粒玻璃珠，用橡皮塞紧塞瓶口，极力振摇，直至混合液呈均匀状态为止。然后吸取0.15mL混合液于载玻片上，盖以盖玻片，并在低倍镜下进行烟虫卵计数，将所得的卵数乘100，即是每毫升粪稀中所含有的蚓虫卵数。
46、19 GB 7959-2012 F. 1 直接检查法附录F(规范性附录)粪稀钩虫卵检查法适用于直接粪便中检查虫卵检查(参照附录E)。F.2 试管滤纸培养法适用于通过培养钩虫幼虫的检查。F.2.1 器材试管长11.5 cm、内径(d)1.5 cmJ、试管架、吸管、载玻片、盖玻片(20mmX 20 mm)、小慑子、显微镜、温箱、解剖镜或放大镜、滤纸条(将滤纸条对折用剪刀剪成宽度略大于试管直径，长度略短于试管的长条，通常大小约为9.0cmX 1. 6 cm，滤纸条要用剪刀剪，防止毛边)、竹签、l日报纸、橡皮筋。F.2.2 栓验步骤F. 2. 2.1 在培养管上贴上标签并写上受检者的姓名和编号。F.2
47、.2.2 每管内加人冷开水约2mL. F.2.2.3 将滤纸条沿长轴纵折，以保持挺直。F.2.2.4 用吸管吸取粪稀或其沉淀物，涂抹于滤纸中段，左右各留0.5cm，上端留1cm，下端留约2cm空白(面积约为4cmX 1. 3 cm)。F.2.2.5 滤纸上面垫以吸水性强的粗草纸，以便吸去多余的水分。将涂布粪稀或其沉淀物的滤纸插入管中，但不应该接触管底，滤纸条插入管中的深度，以水只接触滤纸而不碰到粪稀或其沉淀物为准。F.2.2.6 将培养管置于31c温度中培养4d，或置于26c -30 c温度中培养6d-8d。以保证所有幼虫都有足够的时间发育到感染期幼虫。F.2.2.7 分离幼虫z沿管壁加入45
48、c温水，淹没滤纸上的粪便，1h后用慑子取出滤纸条，弃去。将培养管静置1h，用吸管吸去上清液，幼虫留于管底0.5mL或更少的水内。F.2.2.8 用放大镜(4倍以上)或解剖镜以侧照法检查沉淀物内有无活的幼虫。如有活的幼虫，可先将管底部浸于50c -60 c的热水内抑制活动。F.2.2.9 吸取沉淀物1-3滴于载玻片上，将载玻片置于低倍镜下(10X10)检查，为使可折光的幼虫易于观察，检查时要尽量缩小光圈减弱光线，如需详细辨认幼虫，可加上盖玻片，在高倍镜下(40X10)检查，必要时可用目镜测微计测量幼虫.表F.1 钩虫、羹类圆结虫、东方毛圄结虫丝状蛐鉴别要点特征钩虫粪类圆线虫东方毛圆线虫蛐体*度0.5 mm-O. 7 mm 0.5 mm 0.75 mm 食道长度1/5体长1/2体长1/4体长生殖原基位于蛐体中部位于锄体后部钝圆，有小球状尾端尖细分叉20
