1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准GB/T 5009. 25一2003代替GB/T5009. 25-1996 植物性食品中杂色曲霉素的测定Determination of sterigmatocystin in vegetable foods 2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员GB/T 5009.25-2003 204 前言本标准代替GB/T5009.25-1996(食品中杂色曲霉素的测定方法儿本标准与GB/T5009. 25-1996相比主要修改如下修改了标准的中文名称，标准中文名称改为植物性食品中杂色曲霉素的测
2、定h一一按照GB/T20001. 4-2001(标准编写规则第4部分z化学分析方法对原标准的结构进行了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准第一法由卫生部食品卫生监督检验所、天津市卫生防疫站负责起草。本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草。本标准于1985年首次发布，于1996年第一次修订，本次为第二次修订。GB/T 5009.25-2003 植物性食品中杂色曲霉素的测定1 范围本标准规定了大米、玉米、小麦、黄豆及花生等各种植物性食品中杂色曲霉素的测定方法。本标准适用于大米、玉米、小麦、黄豆及花生等各种植物性食品中杂色曲霉素的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条
3、款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 5009. 22-2003 食品中黄曲霉毒素队的测定3 原理试样中的杂色曲霉素经提取、净化、浓缩、薄层展开后，用三氯化铝显色，再经加热产生一种在紫外光下显示黄色荧光的物质，根据其在薄层上显示的荧光最低检出量来测定试样中杂色曲霉素的含量。4试lliJ4.1同GB/T5009. 22-2003中3.13. 4. 4.2 冰乙酸。4.3 甲酸。4.4 乙
4、醇(95%)。4.5 氯化锅溶液(40日/L)。4.6 三氯化铝-乙醇溶液(200g/L) ，称取20g三氯化铝(AICl，.6H，O)溶于100mL乙醇中，过滤，室温保存。4.7 杂色曲霉素标准溶液z用杂色曲霉素标准品配制成每毫升相当于10用的苯溶液。用紫外分光光度计标定其浓度(最大吸收峰的波长325nm，分子量324，摩尔吸光系数15200)，并作硅胶薄层色谱纯度鉴定，避光，放置于4C冰箱中保存。4.8 杂色曲霉素标准使用液z用苯将10g/mL的杂色曲霉素标准溶液稀释成每毫升相当于1.0和0.40炼的杂色曲霉素标准济液.避光，放置于4C冰箱中保存。5 仪锢5.1同GB/T5009. 22-
5、2003中4.14.4。5.2 玻璃板，10cmXI0 cm与10cmX 18. 5 cm两种。5.3 展开槽z内长10cm、宽4.5cm、高17cm与内长11.5 cm、宽60cm、高19cm. 5.4 玻璃喷雾器。5.5 空气泵或油泵。6 分析步骤6.1 提取大米、玉米、小麦、黄豆及花生z称取20.00g过20日筛的大米、玉米、小麦及黄豆试样(花生试样过205 GB/T 5009.25-2003 10目筛孔).置于具塞锥形瓶中，加80mL甲醇-氯化饷溶液(90+10).振荡30min，过滤。收集试样液40 mL(黄豆、花生试样则取20mL.加入20mL提取剂).移入250mL分液漏斗中，再
6、加入25mL氯化饷溶液(使甲醇与水之体积比为55+45)和25mL石油酶，振摇2min，静置分层。上层石汹隧溶液置锥形瓶中，下层溶液仍移入原分液漏斗中，再用25mL石油隧提取一次。最后将两次上层的石油隧溶液合并，加入25mL甲醇氯化纳溶液(55+45).振摇30s黄豆、花生试样则加入25mL甲醇-氯化纳溶液(70+30) .振摇30sJ.将下层并于原甲醇水层中，重复用甲醇氯化销溶液(55+45)提取两次黄豆、花生试样重复用甲醇氯化纳溶液(70+30)提取一次J.以提取该层的杂色曲霉素。下层溶液合并后加30 mL三氯甲炕(黄豆、花生试样除加三氯甲烧外，再加13mL氯化锅溶液，使甲醇与水的体积比为
7、55+4日，振摇2min，静置。待上层混浊液有部分澄清时，即可将下层溶液经放有约lOg无水硫酸纳的定量慢速滤纸过滤于蒸发皿中。于分液漏斗中再加10mL三氯甲烧，重复提取一次，将该下层溶液和用少量三氯甲烧洗滤器的洗液一并放入蒸发皿中。将蒸发皿放置于65C水浴上挥子，然后再在冰浴上放置2mill-.3 min，加1.0 mL苯将残留物充分混匀，置入小试管中。或将以上蒸发皿中残留物用三氯甲烧移于浓缩管中，于65C用减压吹气法浓缩至干，加入1.0 mL苯，供色谱测定，此1mL大米、玉米及小麦样液各相当于10g试样，1mL黄豆与花生样液则各相当于5g试样。6.2 测定6.2.1 薄层板的制备制备方法同G
8、B/T5009. 22-2003中5.3. 1. 1.一般用5g硅胶G可制成10cmX10cm.厚度0.3 mm的薄层板五块。6.2.2 点样取两块10cmX10 cm薄层板，在距板下端各O.8 cm1 cm基线上滴加标准使用液与样液如下=距左边缘。.8cm1cm处各滴加10L标准使用液(0.4g/mL).在距左边缘4cm处各滴加80L样液(黄豆、花生试样为40L).然后在第二块板的样液点上加滴10L标准使用液(0.4g/mL).在滴加样液时可用吹风机冷风边吹边加。6.2.3 展开6.2.3.1 横向展开.展开剂是乙隧-正己烧苯三氯甲烧-甲酸(3+9+1.5+ 1. 5+0.的15.6mL(由
9、于此混合液不成一相，每一展开槽的用量应单独配制)。用前充分摇匀，一并倒入槽内使用。将靠近标准点的一边，放入槽内展至9cm左右取出挥干。6.2.3.2 纵向展开z展开剂为苯-甲醇-冰乙酸(90+8+2或92.5十6+1.5)15 mL。将靠近标准点与样液点的一边放入槽内，展开9cm左右取出挥干。6.2.4 显荧光在薄层板上喷三氯化铝乙醇溶液(200g/L).置80C加热10min，立即在紫外光灯(波长365nm) 下观察结果，待薄层板冷却后再薄薄的喷第二次(不需加热).可直接观察结果。6.2.5 观察与评定结果在紫外光灯下观察，若第二板的第二点在标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板的相同位置
10、上未出现荧光点，则试样中杂色曲霉素含量在5g/kg以下(黄豆、花生试样为20g/kg以下)，若出现荧光点的强度与标准点的最低检出量的荧光强度相等，而且此荧光点又同第二板样液的标准点相重叠，则试样中杂色幽霉素含量为5问/kg(黄豆、花生试样为20g/kg)，若出现荧光强度比标准点的最低检出量强，则根据其荧光强度估计减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。在喷三氯化铝第一、二次后分别进行观察评定，两次结果应一致。若结果为阳性，则将薄层板放暗处10min，再观察一次，如试样仍为阳性，进一步作确证试验即在距薄层板(10cmX 18.5 cm)
11、下端3cm的基线上滴加一个点的10L标准使用液(0.4g/mL)与3个点的样液，每点16L，在样液的一个点上再加滴10L标准使用液(0.4g/mL).另一点上再加滴10L标准使用液。g/mL)。于各点上再加一小滴三氟乙酸，放暗处反应10min，热风吹5min，使薄206 GB/T 5009.25-2003 层板上的温度不高于40C，用冰乙酸苯(10+90)展开1次2次，直至杂色曲霉素衍生物与杂质分开为止。展开时要避光，以下显荧光步骤同6.2.4.最后将板在紫外光灯下观察，如样液为阳性应产生与杂色曲霉素标准重叠的衍生物。确证法的最低检出量:大米、玉米、小麦为25月/kg(黄豆、花生试样为50g/kg)。6.3 结果计算杂色曲霉素的含量按式(1)进行计算。式中zV鸣、D. . 1 000 x = 0.004 X . ,. -x一一.2 m X 杂色曲霉素含量，单位为微克每千克(g/kg), V1一一一样液浓缩后体积，单位为毫升(mL)，V2一一出现最低荧光样液的滴加体积，单位为毫升(mL)，D-一一浓缩样液的总稀释倍数;m一一浓缩样液中所相当的试祥质量，单位为克(g), 0.004 杂色曲霉素的最低检出量，单位为微克(p.g).结果表示到测定值的整数位。( 1 ) 207
