1、ICS 67050X 04 a雪中华人民共和国国家标准GBT 23502-2009食品中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法Determination of ochratoxin A in food-High performanceliquid chromatographic method with immunoaffinity column cleanup2009-04-08发布 2009050 1实施宰瞀髁鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会议1”刖 昌GBT 23502-2009本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国食品工业标准化技术委员会(SACTC 64)提出。本标
2、准由全国食品工业标准化技术委员会食品通用检测技术分技术委员会(SACTC 64SC 8)归口。本标准起草单位：青岛市产品质量监督检验所、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中检维康技术有限公司、青岛啤酒股份有限公司。本标准主要起草人：吴如军、鲍蕾、张辉珍、李惠颖、张鹏、余俊红、王雄。食品中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法GBT 23502-20091范围本标准规定了食品中赭曲霉毒素A含量的免疫亲和层析净化高效液相色谱测定方法。本标准适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中赭曲霉毒素A含量的测定。本标准的方法检出限：粮食和粮食制品的检出限为10 pgkg，酒类的检出限为
3、o1 pgkg，酱油、醋、酱及酱制品的检出限为05 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，IS0 3696：1987，MOD)3方法提要用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为
4、符合GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42乙腈：色谱纯。43冰乙酸：色谱纯。44提取液1：甲醇+水(80+20)。45提取液2：称取150 g氯化钠、20 g碳酸氢钠溶于约950 mL水中，加水定容至1 L。46冲洗液：称取25 g氯化钠、5 g碳酸氢钠溶于约950 mL水中，加水定容至l L。47真菌毒素清洗缓冲液：称取250 g氯化钠、50 g碳酸氢钠溶于水中，加入01 mL吐温一20，用水稀释至1 L。48赭曲霉毒素A标准品：纯度98。49赭曲霉毒素A标准储备液：准确称取一定量的赭随霉毒素A标准品，用甲醇+乙腈(1+1)溶解，配成01 mgmL的标准储备液，在-20保存，可
5、使用3个月。410赭曲霉毒素A标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的赭曲霉毒素A储备液，用流动相稀释，分别配成相当于1 ngmL、5 ngmL、10 ngmL、20 ngmL、50 ngmL的标准工作液，4保存，可使用7 d。411赭曲霉毒素A免疫亲和柱。412玻璃纤维滤纸：直径11 cm，孔径15 pm，无荧光特性。5仪器和设备51天平：感量0001 g。1GeT 23502-200952高效液相色谱仪：配有荧光检测器。53均质器：转速大于10 000 rmin。54高速万能粉碎机：转速10 000 rmin。55玻璃注射器：10 mL。56试验筛：1 mm孔径。57空气压力泵。58超声
6、波发生器：功率大于180 W。6分析步骤61试样的制备与提取611粮食和粮食制品：将样品研磨，硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过试验筛(56)，不要磨成粉末。称取20 g(精确到001 g)磨碎的试样于100 mL容量瓶中，加人5 g氯化钠，用提取液1(44)定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌提取2 rain。定量滤纸过滤，移取100 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。612酒类：取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4冰箱冷藏30 rain，过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20 g(精
7、确到001 g)，置于25 mL容量瓶中，加提取液2(45)定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B于干净的容器中。61，3酱油、醋、酱及酱制品：称取25 g(精确到0Ol g)混匀的试样，用提取液1(44)定容至500mL，超声提取5 min。定量滤纸过滤，移取100 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液c于干净的容器中。62净化621粮食和粮食制品：将免疫亲和柱连接于玻璃注射器(55)下，准确移取61中滤液A 100 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴s的流速通过免疫亲和柱
8、，直至空气进入亲和柱中，依次用10 mL真菌毒素清洗缓冲液(47)、10 mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1滴s2滴s，弃去全部流出液，抽干小柱。622酒类：将免疫亲和柱连接于玻璃注射器(55)下，准确移取61中滤液B 10。0 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10 mL冲洗液(46)、10 mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1滴s2滴s，弃去全部流出液，抽干小柱。623酱油、醋、酱及酱制品：将免疫亲和柱连接于玻璃注射器(55)下，准确移取61中滤液C100 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃
9、注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10 mL真菌毒素清洗缓冲液(47)、10 mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1滴s2滴s，弃去全部流出液，抽干小柱。63洗脱准确加入10 mL甲醇洗脱，流速约为1滴s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，用甲醇定容至1 mL，供HPLC测定。64高效液相色谱参考条件a) 色谱柱：c18柱，5 pm，150 mrnX46 mill或相当者；b)流动相：乙腈+水+冰乙酸(99+994-z)；c)流速：09 rnLmin；d)柱温：35；e) 迸样量：10弘L100 pL；2GBT 23502-2009f)检测波长
10、：激发波长333 Dm，发射波长477 Dm。65定量测定以赭曲霉毒素A标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中赭曲霉毒素A的响应值均应在仪器检测线性范围内。在上述色谱条件下，赭曲霉毒素A标准品色谱图参见图A1。66空白试验除不加试样外，空白试验应与测定平行进行，并采用相同的分析步骤。67平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7结果计算试样中赭曲霉毒素A的含量按式(1)计算：。 (“一c。)V1 000一 m1 000式中：x试样中赭衄霉毒素A的含量，单位为微克每千克(pgkg)；c-试样溶液中赭曲霉毒素A的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；Co空白试样溶液中赭曲霉毒素A的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；y甲醇洗脱液体积，单位为毫升(mL)；m试样的质量，单位为克(g)；，稀释倍数。检测结果以两次测定值的算术平均值表示。计算结果表示到小数点后1位。8回收率添加浓度在10 pgkg100 ugkg时，回收率在70100之问。9重复性在重复性条件下，获得的赭曲霉毒素A的两次独立测试结果的绝对差值不大于其算术平均值的10。GBT 23502-2009附录A(资料性附录)赭曲霉毒素A标准品的液相色谱图图A1 赭曲霉毒素A标准品液相色谱图00000O00舳与i弧札m咕
