1、ICS 07.100.30 C 53 道B中华人民共和国国家标准GB/T 19915.3-2005 猪链球菌2型PCR定型检测技术Method for detectioD Stre ptococcus suis type 2 by PCR 2005-09-27发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员?2005-11-01实施060609000419 中华人民共和国国家标准猜链球菌2型PCR定型检测技术GB/T 19915.3-2005 * 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦
2、皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X 1230 1/16 印张0.5字数8千字2005年12月第一版2005年12月第一次印刷* 书号:155066 1-26802 定价8.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 19915.3-2005 前猪链球菌病是链球菌属中猪源链球菌引致的猪链球菌病的总称，其病原主要有猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种。猪链球菌2型可引起猪败血症、脑膜炎等。人可通过伤口感染该菌，并导致死亡。为控制和预防该菌引致的猪链球菌病，建立快速、特异、敏感的检测方法是当务之急。本标准是采用公认的细菌学诊断的现代分子生物学
3、技术制定的。本标准的附录A是规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位z南京农业大学。本标准主要起草人z陆承平、范红结、姚火春、何孔旺。I GB/T 19915.3-2005 猪链球菌2型PCR定型检测技术1 范围本标准规定了猪链球菌2型的PCR的定型方法。本标准适用于由猪链球菌2型引致的病死猪分离菌的检测和定型。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是
4、不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 猪链球菌2型Stre ptococcus suis type 2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其英膜多糖抗原的差异，可分为1-34及1/2共35个血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。4 测定方法4. 1 方法提要挑取可疑细菌培养物菌落加入PCR反应管中，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与标准分子量标记比较，确定扩增产物的大小。4.2 试剂
5、和材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的灭菌双蒸水。4.2.1 猪链球菌2型定型PCR反应混合物和猪链球菌2型定型套式PCR反应混合物。4.2.2 Taq DNA聚合酶。4.2.3 琼脂糖1电泳级。4.2.4 澳化乙链。4.2.5 分子量标记:DL-2000。4.2.6 TE缓冲液:10mmol/LTris-HCl(pH 8.0) , 1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。4.2.7 10XPCR缓冲液:100 mmol/L KCl , 160 mmol/L(NH4 )2S04 , 20 mmol/L MgS04 ,200 mmol/L Tris-HCl
6、(pH 8.肘，1%TritonX-100 , 1 mg/mL BSA。4.2.8 电泳缓冲液:242 g Tris碱，57.1 mL冰乙酸，100mL O. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)，加蒸铺水至1 000 mL，使用时10倍稀释。4.2.9 加样缓冲液:0.25%澳酣蓝，40%煎糖。4.2. 10 英膜基因PCR引物和英膜基因套式PCR引物。4.2. 11 阳性对照和阴性对照。GB/T 19915.3一20054.3 仪器和设备4.3. 1 离心机。4.3.2 DNA热循环仪。4.3.3 核酸电泳仪。4.3.4 pH 计。4.3.5 移液器:10L、20L、100L、1000
7、L。4.3.6 紫外线透射仪或凝胶成像系统。4. 4 英膜基因PCR操作步骤4.4.1 PCR扩增用铀金耳钓取血平板上自9百I匀，加入Taq酶(5U/ IlL) 0.h L , 200Q 对照。扩增条件为:950C保存。按SangongP 4.4.2.1在254.4.2.2 将混1 min。(el ution buffer) 4.4.2.712000 4.4.3 酶切Hind II 10 X buffer ?昆匀，370C酶切2h。4.4.4 琼脂糖凝股电泳在电泳缓冲液中加入1%琼脂糖;而热战华且今LPCR反应混合物的PCR管中，混扩增，同时设阳性对照和阴性中，12000g室温2L洗脱缓冲液产
8、物加入2L5X上样缓冲液，混匀后加入上样孔，80V恒压电泳20min，紫外线透射检测。4.4.5 检测猪链球菌2型英膜基因的套式PCR用铅金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型定型套式PCR反应混合物的PCR管中，混匀，加入Taq酶(5U/ IlL) 1.0L，2000 r/min离心105，立即进行PCR扩增。扩增条件为:950C预变性3min;950C40 5 , 550C30 5 , 720C40 5，30个循环;720C延伸7min，40C保存。5 结果及判断5. 1 试验结果成立条件阳性对照经英膜基因PCR扩增产物酶切后出现164bp和223bp两条条带后，阳性对照经套式2
9、GB/T 19915.3-2005 PCR出现178bp及387bp两条条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立，否则，结果不成立。5.2 结果判断在试验结果成立的前提下，如果样品中英膜基因PCR产物酶切后出现164bp和223bp两条条带，或套式PCR出现178bp及387bp两条条带，表明猪链球菌2型英膜基因阳性，再结合液体培养出现短链的特性，可确诊为猪链球菌2型。6 废弃物处理和防止污梅的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。mCON-m.-gFH阁。GB/T 19915.3-2005 附录(规范性附景)猪链球菌2型快速检测程序A 猪链球菌2型快速检测程序见图A.l。PCR 回收387bp片段、酶切、电泳结果判断z分离菌为猪链球菌2型侵权必究书号:155066 1-26802 定价:8.00元* 版权专有猪链球菌2型快速检测程序圄A.1
