1、ICS 07.100.30 C 53 道:中华人民共和国国家标准GB/T 19915.6-2005 猪源链球菌通用荧光PCR检测方法Method of the real-time PCR for the detection of Stre ptococcus suis 2005-09-27发布2005斗1-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局也士中国国家标准化管理委员会Q(.l IJ 060609000416 GB/T 19915.6-2005 前本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位
2、:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国兽医药品监察所。本标准主要起草人z张鹤晓、宋立、高志强、宁宜宝、周琦、乔彩霞、杨承槐、吴丹、谷强。本标准系首次发布的国家标准。I GB/T 19915.6一2005猪源链球菌通用荧光PCR检测方法1 范围本标准规定了猪源链球菌通用荧光PCR检测方法。本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪源链球菌的检测。2 规范性引用文件3 缩略语的修改单(不包括勘误的内容)达成协议的各方研究准。荧光PCRCt值DNA Taq酶PBS 4 原理C 录附中A哇nu nu q缸。叫uA性Qd T JJJ B G 见理，管，与置-设h化h准标的室验验实实j
3、duu福州VWM检足协忻mm火，什这到E退收、循光荧方双入吸队的荧gm光A进所附应用MER应团针反通叫的剧反基探顶帽球T性工及Q将F臼链用异记旦被能着时源采特际。号功随制猪和端号信酶苦物MJ信光酸收5R基团发出的荧的53的外切核吸收而被检测仪所接6 试剂和材料6. 1 试荆除另有说明，所用试剂均为分析纯。6. 1. 1 元水乙醇:一20.C预冷。6. 1. 2 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和无DNA酶的灭菌纯化水配制，一20.C预冷。6. 1. 3 0.01 mol/L pH 7.2的PBS:配方见附录A，021土2).C、15min高压灭菌冷却。GB/T 19915.6-2005 6. 1
4、. 4 猪源链球菌通用荧光PCR检测试剂盒1):试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录Bo6.2 仪器设备6.2. 1 高速台式冷冻离心机:最大转速13000r/min以上。6.2.2 荧光PCR检测仪、计算机。6.2.3 20C .8C冰箱和-20oC冰箱。6.2.4 微量移液器:0.5L.lOL，5L.20L，20L-200L，200L-1000L。6.2.5 组织匀浆器。6.2.6 昆匀器。7 样晶的采集与前处理来样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。7. 1 取样工具7. 1. 1 棉拭子、剪刀、慑子、研钵、Eppendorf管。7. 1.2 所有上述取样工
5、具应经021:l:2)c、15min高压灭菌并烘干或经1600C干烤2h。7.2 采样方法7.2.1 生猪拭子样晶咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上腾来回刮3次-5次，取咽喉分泌液。7.2.2 扁桃体、内脏或肌肉样晶用无菌的剪刀和慑子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5.0mL PBS t昆匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。7.2.3 血清或血浆用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。7.3 存放与运送采集或处理的样本在20C-8.C条件下保存应不超过24h;若需长期保存，须放置一70.C冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融3次)。采集的
6、样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。8 操作方法8. 1 样本核酸的提取在样本处理区进行。8. 1. 1 提取方法18. 1. 1. 1 取n个1.5 mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。8. 1. 1.2 每管加入1.0 mL裂解液，然后分别加人待测样本、阴性对照和阳性对照各100L，一份样本换用一个吸头，氓匀器上震荡棍匀5s，于40C-25.C条件下，10000 r/mn离心10mno 8.1. 1. 3 取与8.1. 1. 1中相同数量的1.5 mL灭菌Eppendorf管，加入500L无水乙醇(一2
7、00C预冷)，对每个管进行编号。吸取8.1. 1. 2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液要充分吸取，不要吸出底部沉淀，颠倒棍匀。8. 1. 1.4 于40C.25.C条件下.5000 r/min离心5mn (Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入1.0 mL 2 1)由指定单位提供，给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GB/T 19915.6一200575%乙醇，颠倒洗涤。8. 1. 1.5 于4.C25.C条件下.5
8、000 r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。8. 1. 1. 6 4 000 r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5S 15 s。不宜过于干燥，以免DNA不溶。8. 1. 1. 7 加入11L无DNA酶的灭菌纯化水，轻轻混匀，榕解管壁上的DNA，2000 r/min离心5s , 冰上保存备用。8. 1. 2 提取方法28. 1.2. 1 取n个1.5 mL灭菌Eppendorf管，其中
9、n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。8. 1.2.2 每管加入100LDNA提取液1，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各100L，一份样本换用一个吸头，混匀器上震荡?昆匀5s，于4.C25.C条件下，13000 r/min离心10min。8.1.2.3 尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入10LDNA提取液2，混匀器上震荡混匀5s。于4.C25.C条件下，2000r/min离心10So 8. 1. 2. 4 1000C干洛或沸水浴10min;加入40L无DNA酶的灭菌纯化水，13000r/min离心10min , 上清即为提取的DNA，冰上保存备用。8.1
10、.3 DNA提取后的处理要求提取的DNA须在2h内进行PCR扩增或放置于一700C冰箱。8.2 扩增试荆准备与配制在反应?昆合物配制区进行。从试剂盒中取出猪源链球菌通用荧光PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5S。设所需PCR数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需使用15LPCR反应液及0.3LTaq酶。计算各试剂的使用置，加入一适当体积试管中，向每个PCR管中各分装15L，转移至样本处理区。8.3 加样在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入8.1. 1. 7或者8.1. 2. 4中制备的DNA溶液10L，使总体积达25
11、L。盖紧管盖后，500r/min离心30So 8.4 荧光PCR反应在检测区进行。将8.3中加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置:一一第一阶段，预变性920C3 min; 一一第二阶段，920C5 s , 600C 30 s，45个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。9 结果判定9. 1 结果分析条件设定读取检测结果。阔值设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。9.2 质控标准9.2. 1 阴性对照元。值并且无扩增曲线。9.2.2 阳性对照的Ct值应30.0，并出现特定的扩增曲线。9.2.3
12、 如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。3 GB/T 19915.6-2005 9.3 结果描述及判定9.3. 1 阴性无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猪源链球菌。9.3.2 阳性Ct值30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪源链球菌。4 GB/T 19915.6-2005 附录A(规范性附景)磷酸盐缓冲生理盐水配方A.1 A液(0.2mol/L磷酸二氢铀水溶液)一水合磷酸二氢铀(NaH2P04 H20)27. 6 g，溶于蒸馆水中，最后稀释至1000mL。A.2 B液(0.2mol/L磷酸氢二锅水溶液七水合磷酸氢二铀(NazHP04 7H20) 53. 6 g ,
13、 或十二水合磷酸氢二铀(NazHP04 12HzO) 71. 6 g或二水合磷酸氢二铀(Na2HP04 2H20)35. 6 gJ加蒸锢水溶解，最后稀释至1000mL。A.3 0.01 mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水的配制0.2 mol/L A液0.2 mol/L B液氯化铀用蒸锢水稀释至1000mL。14 mL 36 mL 8.5 g 5 GB/T 19915.6-2005 附录B(资料性附录)猪源链球菌通用荧光PCR试荆盒组成、说明及使用时的注意事项B. 1 试剂盒的组成试剂盒的组成见表B.1。表B.1猪源链球菌通用荧光PCR试荆盒的组成组成(48tests/盒)数量裂解液(提取
14、方法1)或DNA提取液l(提取方法2)，DNA48 mLX 1盒(裂解液)或5 mLX1管(DNA提取液1)，提取液2(提取方法2)1. 6 mLX 1管(DNA提取液2)猪源链球菌通用荧光PCR反应液750LX1管Taq酶(5U/L) 15LX1管无DNA酶的灭菌纯化水1 mLX1管阴性对照1 mLX1管阳性对照1 mLX1管B.2 说明B. 2.1 裂解液外观为浅绿色，于4.C保存;DNA提取液1.2为无色液体，一20.C保存。B.2.2 无DNA酶的灭菌纯化水，用于榕解提取的DNA。B. 2. 3 PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。B.3 使用时的注意事项B. 3.1 由于阳
15、性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。B.3.2 反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。B.3.3 除裂解液外，其他试剂-20.C保存，有效期为6个月。6 的OON|.的FgFH筒。华人民共和国家标准猪源链球菌通用荧光PCR检测方法GB/T 19915.6-2005 国中 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销4峰印张O.75 字数11千字2005年12月第一次印刷开本880X12301/16 2005年12月第一版定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533 书号:155066 1-26805
