1、ICS 07.100.30 C 53 道昌中华人民共和国国家标准G/T 19915.8-2005 猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测方法Protocol of real-time PCR assay for virulence factors of Streptococcus suis type 2 2005-09-27发布2005斗1-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会060609000414 GB/T 19915.8一2005前吉罔本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化管理委员会归口。本标准由中国检验检疫
2、科学研究院和江苏出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人E林祥梅、吴绍强、韩雪清、贾广乐、刘建、梅琳、陈国强、张敬友、姜巍、唐泰山。本标准为首次发布。I G/T 19915.8-2005 1 范围猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测方法本标准规定了猪链球菌2型毒力因子MRP和EF检测的荧光PCR操作方法。本标准适用于检测生猪拭子、增菌培养物、疑似病料及猪组织样品中猪链球菌2型菌株的致病力。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 毒力因子virulence factor 猪链球菌2型菌株的致病力与其毒力因子直接相关。猪链球菌2型的毒力因子有溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、
3、溶血素、英膜多糖以及44kDa蛋白、IgG结合蛋白、纤毛粘着素等。其中，溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)是最主要的两个毒力因子，可作为判定菌株毒力的指标。一般认为表型MRP十EF+为强致病株，MRP+EF一为弱致病株，MRP-EF一为非致病株，未发现MRP一EF+表型。3 缩暗语本标准采用下列缩略语:荧光PCR岛1RPEF Ct值FAM TAMRA 4 实验材料与仪器4. 1 实验试剂实验试剂包括:荧光聚合酶链反应溶菌酶释放蛋白胞外因子荧光信号到达设定的阔值所经历的循环数6-竣基荧光素四甲基罗丹明一一-猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测引物、探针、阳性对照及常规PCR反应试剂;商品化
4、的组织基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。4.2 仪器所用仪器包括:荧光PCR仪;高速冷冻离心机;一一台式离心机;一旋涡1昆匀器;一一冰箱(2.C8.C和一20.C两种); -一一微量可调移液器(0.1L2L、2L20L、20L200L、100Ll000L等规格)和相应配套的吸头。1 GB/T 19915.8-2005 5 操作方法5. 1 方法概要荧光PCR方法是一种快速、灵敏、特异的检测病原体的方法。本研究选择猪链球菌2型的MRP和EF两个毒力因子基因设计引物进行PCR，同时在扩增序列中间设计了荧光探针，进行多重荧光PCR检测。反应结束即可根据扩增曲线判定有无目的基因，从而
5、确定待检菌是否含有猪链球菌2型MRP和EF毒力因子基因，并据此判定其致病力。5.2 操作步骤5.2.1 实时荧光PCR扩增体系取1L培养菌液或从组录A。5.2.2 PCR 6 结果判定6. 1 判定方法反应结束后，阂为准。仪器将自动给6.2 阳性判定如果MRP的PCR扩MRP阳性菌株，以有无EF基因弱致病株(目前未有MRP-EF+毒型6.3 阴性判定如果反应曲线Ct二三40，则为阴性。6.4 可疑判定入按照表l配制的PCR反应液中。注意的问题见附品扩增曲线的最高点为猪链球菌2型致病株;对于+EF十为强致病株，MRP+EF一为一为非致病株。如果30Ct40，判为可疑，可以加大模板量再重复扩增，如
6、果重复试验的Ct40，则判为阳性，否则为阴性。6.5 无效扩增如果阳性对照没有扩增曲线，或者阴性对照有Ct30的扩增曲线，判定本次试验无效，需要分析试验失败原因，并重新试验。2 GB/T 19915.8-2005 附录A(规范性附录)检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施A.1 样品处理过程中必须戴一次性手套，并经常更换。PCR反应液配制过程中应在超净工作台等洁净环境中进行。A.2 抽样和制样工具必须清洁干净，且用于试验的器皿和离心管、PCR管等必须经过121.C、15min 高压灭菌后才可使用。A.3 引物、探针等溶液应按照实际工作浓度一次性溶解好，并分装后使用，防止试验过程中污染。A.4
7、试验前后，要把超净工作台的紫外灯打开，以破坏可能残留的DNA。A.5 上机运行前应检查各PCR管盖是否盖紧，以防荧光物质世露而污染机器。mCON-.mFFH阁。华人民共和国家标准猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测方法GB/T 19915.8-2005 国白* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销铃印张0.5字数6千字2005年12月第一次印刷开本880X1230 1/16 2005年12月第版定价8.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533 书号，155066 1-26772
