1、ICS 07.100.30 C 53 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 19915. 7-2005 猪链球菌2型荧光PCR检测方法Method of the real-time PCR for the detection of Streptococcus suis type 2 2005-09-27发布中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员j2005-11-01实施哩060609000415 G/T 19915.7-2005 前言本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位z中
2、华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国兽医药品监察所。本标准主要起草人t张鹤晓、宋立、高志强、宁宜宝、乔彩霞、王甲正、杨承槐、吴丹、谷强。本标准系首次发布的国家标准。I GBjT 19915.7-2005 猪链球菌2型荧光PCR检测方法1 范围本标准规定了猪链球菌2型荧光PCR检测方法。本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪链球菌2型的检测。2 规范性引用文件的修改单(不包括勘误的内容)或GB/ T 19438.1-2004 3 缩暗语值A酶NGB CDTP 4 原理采用TaqMan方国，因的特异性引物和特(用R表示)，3端标记团发出的荧光信号。PC基团发出的荧光信号被Q3
3、的外切核酸酶功能将探被检测仪所接收。随着PCR5 猪链球菌2型荧光PCR检测冒猪链球菌2型荧光PCR检测实验6 试剂和材料6. 1 试剂除另有说明，所用试剂均为分析纯。6. 1. 1 无水乙醇:一200C预冷。6.1.2 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和无DNA酶的灭菌纯化水配制，一200C预冷。6.1.3 0.01 mol/L pH7. 2的PBS:配方见附录A，(121:1:2)OC、15min高压灭菌冷却。GB/T 19915.7-2005 6. 1. 4 猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒飞试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B。6.2 仪器设备6.2. 1 高速台式冷冻离心机E最大
4、转速13000 r/min以上。6.2.2 荧光PCR检测仪、计算机。6.2.3 2.C 8 .C冰箱和-20.C冰箱。6.2.4 微量移液器:0.5L-10L，5L20L，20L，-， 200L，200L，-， 1 000L。6.2.5 组织匀浆器。6.2.6 t昆匀器。7 样晶的采集与前处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。7. 1 取样工具7. 1. 1 棉拭子、剪刀、慑子、研钵、Eppendorf管。7.1.2 所有上述取样工具必须经(121士2).C、15min高压灭菌井烘干或经160.C干烤2h。7.2 采样方法7.2.1 生猪拭子样晶咽喉拭子采样，
5、采样时要将拭子深入喉头及上膊来回刮3次-5次，取咽喉分泌液。7.2.2 扁桃体、内脏或肌肉样晶用无菌的剪刀和慑子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5.0mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。7.2.3 血清或血搜用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。7.3 存脑与运送采集或处理的样本在2oC -8 .C条件下保存应不超过24h;若需长期保存，须放置一70.C冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。8 操作方法8. 1 样本核酸的提取在样本处理区进行。8. 1. 1
6、提取方法18. 1. 1. 1 取n个1.5 mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及-管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。8. 1. 1.2 每管加入1.0 mL裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各100L，一份样本换用一个吸头;1昆匀器上震荡混匀5s。于4oC -250C条件下，10000 r/mn离心10min。8. 1. 1.3 取与8.1. 1. 1中相同数量的1.5 mL灭菌Eppendorf管，加入500L无水乙醇C-20 .C预冷)，对每个管进行编号。吸取8.1. 1. 2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液要充分吸取，不要吸出底
7、部沉淀，颠倒混匀。8. 1. 1.4 于4oC 250C条件下，5000 r/min离心5minCEppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入1.0 mL 2 1) 囱指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GB/T 19915.7-2005 75%乙醇，颠倒洗诲。8. 1. 1.5 于4oC 250C条件下，5000 r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清液，倒置于吸水
8、纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。8.1. 1. 6 4000 r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5s15s。不宜过于干燥，以免DNA不溶。8. 1. 1. 7 加入11L无DNA酶的灭菌纯化水，轻轻泪匀，溶解管壁上的DNA，2000 r/min离心5s , 冰上保存备用。8.1.2 提取方法28. 1.2. 1 取n个1.5 mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。8. 1. 2. 2 每管加入100LDNA提取液1，
9、然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各100L，一份样本换用一个吸头，混匀器上震荡混匀5s，于4oC250C条件下，13000 r/min离心10mino 8.1.2.3 尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入10LDNA提取液2，棍匀器上震荡混匀5s。于4oC 250C条件下，2000 r/min离心10So 8.1.2.4 1000C干浴或沸水浴10min;加入40L无DNA酶的灭菌纯化水，13000r/min离心10min , 上清即为提取的DNA，冰上保存备用。8.1.3 DNA提取后的处理要求提取的DNA须在2h内进行PCR扩增或放置于70 oC冰箱。8.2 扩增试剂准备与配制在反应混
10、合物配制区进行。从试剂盒中取出猪链球菌2型荧光PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000 r/min离心5S。设所需PCR数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需使用15LPCR反应液及O.3L Taq酶。计算各试剂的使用量，加人一适当体积试管中，向每个PCR管中各分装15L，转移至样本处理区。8.3 加样在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入8.1. 1. 7或者8.1. 2. 4中制备的DNA榕液10L，使总体积达25L。盖紧管盖后，500r/min离心30S。8.4 荧光PCR反应在检测区进行。将8.3中加样后的PCR管放入荧光PCR检
11、测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置:一一第一阶段，预变性920C3 min; 第二阶段，92oC 5 s , 60 oC 30 s，45个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。9 结果判定9. 1 结果分析条件设定读取检测结果。阔值设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。9.2 质控标准9.2. 1 阴性对照元Ct值并且无扩增曲线。9.2.2 阳性对照的Ct值应30.0，并出现特定的扩增曲线。9.2.3 如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。3 GB/T 19915.7-2005 9.3 结果描述及判定9.
12、3. 1 阴性元。值并且无扩增曲线，表明样品中无猪链球菌2型。9.3.2 阳性Ct值运30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪链球菌2型。4 GB/T 19915.7-2005 附录A(规范性附录)磷酸盐缓冲生理盐水配方A.1 A液(0.2mol/L磷酸二氢铀水溶液)一水合磷酸二氢铀(NaH2P04 H20)27. 6 g.溶于蒸锢水中，最后稀释至1000 mL。A.2 B液(0.2moI/L磷酸氢二锅水溶液)七水合磷酸氢二铀(Na2HP04 7H20) 53. 6 g. 或十二水合磷酸氢二铀(Na2HP04 12H20) 71. 6 g或二水合磷酸氢二铀(Na2HP04 2H20)3
13、5. 6 gJ加蒸馆水榕解，最后稀释至1000mL。A.3 0.01 moI/L、pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水的配制0.2 mol/L A液14mL 0.2 mol/L B液36mL 氯化铀8.5 g 用蒸馆水稀释至1000 mL。5 GB/T 19915.7-2005 附录B(资料性附录)猪链球菌2型荧光PCR试荆盒组成、说明及使用时的注意事项B.1 试剂盒的组成试剂盒的组成见表B.l。表B.1猪链球菌2型荧光PCR试剂盒组成组成(48tests/盒)数量裂解液(提取方法1)或DNA提取液l(提取方法2), DNA 48 mLX 1盒(裂解液)或5mLX 1管(DNA提取液1)，I 提取液2
14、(提取方法2)1. 6 mLX 1管(DNA提取液2)猪链球菌2型荧光PCR反应液750LXl管Taq酶(5U/I1L)15LXl管无DNA酶的灭菌纯化水1 mLXl管阴性对照1 mLX1管阳性对照1 mLXl管B.2 说明B.2.1 裂解液为DNA提取试剂，外观为浅绿色;DNA提取液1，2为无色液体，-20.C保存。B.2.2 元DNA酶的灭菌纯化水，用于溶解提取的DNA。B. 2. 3 PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。B.3 使用时的注意事项B. 3.1 由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。B.3.2 反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管
15、是否盖紧，以免荧光物质世漏污染仪器。B.3.3 除裂解液外，其他试剂-20.C保存，有效期为6个月。6 mCON-h.的52H阁。华人民共和国家标准猜链球菌2型荧光PCR检测方法GB/T 19915.7-2005 国白 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 印张0.75字数11千字2005年12月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2005年12月第一版* 书号:155066 1-26806定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533
